化療耐受是影響腫瘤患者不良預(yù)后的重要原因之一,膀胱癌作為典型實體瘤,對多種化療藥物具有高耐受性。因此,深入理解膀胱癌化療耐受的分子機制至關(guān)重要。腫瘤細胞凋亡調(diào)控通路異常是其抵御化療藥物誘導(dǎo)殺傷效應(yīng)的重要手段之一。腫瘤細胞凋亡受多種因子調(diào)控,其中p53是影響腫瘤細胞凋亡調(diào)控重要調(diào)控因子,p53通過調(diào)控凋亡相關(guān)靶基因表達,進而影響腫瘤細胞凋亡。而p53在細胞內(nèi)受多種調(diào)控因子影響。其中,iASPP是p53的重要抑制因子,iASPP能結(jié)合并抑制p53對下游抗氧化靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,進而抑制腫瘤細胞凋亡,因此發(fā)揮原癌基因的作用。iASPP屬于ASPPs蛋白家族,大量研究顯示iASPP在多種腫瘤中高表達,并與腫瘤化療耐受有關(guān),但iASPP調(diào)控腫瘤化療耐受的分子機制研究的不夠深入。此外,iASPP在膀胱癌中表達水平與作用未知,有待發(fā)掘。本文通過實時熒光定量PCR、免疫組化和免疫印跡等實驗手段,證實iASPP m RNA水平與蛋白水平在膀胱癌組織和細胞中均顯著升高。隨后本文檢測細胞活力后發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞化療耐受與iASPP有關(guān)。通過外源過表達和RNAi干擾技術(shù),證實iASPP干擾后的細胞耐藥性下降,iASPP過表達則細胞耐藥性上升。本文進一步利用細胞流式分析和實時熒光定量PCR技術(shù)研究iASPP增強膀胱癌細胞耐藥機制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),iASPP通過抑制ROS水平來發(fā)揮細胞凋亡抑制的作用,同時還發(fā)現(xiàn)iASPP抑制凋亡基因Bax m RNA表達,促進抗凋亡基因Bcl-2m RNA表達。進一步通過核質(zhì)組分分離實驗,發(fā)現(xiàn)iASPP主要定位于細胞質(zhì),且這些膀胱癌細胞中p53發(fā)生功能抑制性突變。本文為進一步明確iASPP調(diào)控膀胱癌細胞凋亡的分子機制,本文利用實時熒光定量PCR和免疫印跡等手段檢測發(fā)現(xiàn)iASPP提高Nrf2蛋白水平及其下游抗氧化靶基因表達(FTH1、HMO1、NQO1),但對Nrf2 m RNA以及Keap1蛋白水平?jīng)]有影響。綜上,本研究證實iASPP在膀胱癌中高表達,并且可能以p53非依賴性方式,提高Nrf2蛋白水平,Nrf2抗氧化靶基因以及促凋亡Bax的表達,抑制凋亡抑制因子Bcl-2表達,抑制ROS水平,抑制細胞凋亡,進而增強膀胱癌細胞對多種化療藥物的耐受。本研究將為膀胱癌耐藥機制研究提供新的思路。
【學(xué)位單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 課題來源及研究背景和意義
    1.2 國內(nèi)外在該方向的研究現(xiàn)狀及分析
        1.2.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.2 國內(nèi)外文獻綜述的簡析
    1.3 主要研究內(nèi)容
        1.3.1 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表達水平研究
        1.3.2 iASPP對膀胱癌細胞化療耐藥的影響
        1.3.3 iASPP調(diào)控膀胱癌耐藥分子機制的研究
    1.4 技術(shù)路線圖
第2章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料試劑
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法和步驟
        2.2.1 載體構(gòu)建
        2.2.2 質(zhì)粒提取
        2.2.3 細胞的復(fù)蘇
        2.2.4 細胞傳代培養(yǎng)
        2.2.5 細胞凍存
        2.2.6 細胞瞬時轉(zhuǎn)染
        2.2.7 免疫印跡實驗
        2.2.8 實時熒光定量PCR
        2.2.9 MTT法測定細胞半致死率
        2.2.10 細胞核質(zhì)分離實驗
        2.2.11 細胞凋亡檢測
        2.2.12 細胞活性氧水平檢測
        2.2.13 免疫組化
第3章 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表達水平研究
    3.1 膀胱癌組織中iASPP表達水平研究
        3.1.1 免疫組化檢測iASPP蛋白水平
        3.1.2 組織免疫印跡檢測iASPP蛋白水平
        3.1.3 組織實時熒光定量PCR檢測iASPPmRNA水平
    3.2 膀胱癌細胞系中iASPP表達水平
        3.2.1 膀胱癌細胞中iASPPmRNA表達水平
        3.2.2 膀胱癌細胞中iASPP蛋白表達水平
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第4章 iASPP對膀胱癌細胞化療耐藥的影響
    4.1 膀胱癌細胞化療藥物的耐受性
    4.2 內(nèi)源iASPP對膀胱癌細胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.1 iASPP過表達載體的構(gòu)建
        4.2.2 內(nèi)源iASPP蛋白對5637細胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.3 內(nèi)源iASPP蛋白對T24細胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.4 外源過表達iASPP蛋白對T24細胞化療藥物耐受性的影響
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
第5章 iASPP調(diào)控細胞耐藥分子機制的初步研究
    5.1 iASPP通過抑制膀胱癌細胞ROS而抑制細胞凋亡
        5.1.1 iASPP蛋白下調(diào)與外源過表達效率驗證
        5.1.2 內(nèi)源iASPP對膀胱癌細胞凋亡水平的影響
        5.1.3 外源過表達iASPP對T24細胞凋亡水平的影響
        5.1.4 iASPP對膀胱癌細胞ROS水平的影響
        5.1.5 ROS對iASPP調(diào)控膀胱癌細胞凋亡的影響
    5.2 iASPP可能以p53非依賴方式抑制膀胱癌細胞凋亡
        5.2.1 膀胱癌T24、5637細胞p53基因均為突變型
        5.2.2 iASPP蛋白在細胞質(zhì)中表達較多
    5.3 內(nèi)源iASPP對膀胱癌細胞Nrf2及下游靶基因的影響
    5.4 外源過表達iASPP對T24細胞Nrf2及下游靶基因的影響
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果
致謝

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 羅楠;iASPP在慢性粒細胞白血病非BCR-ABL依賴型耐藥機制的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2865597