化療耐受是影響腫瘤患者不良預(yù)后的重要原因之一,膀胱癌作為典型實(shí)體瘤,對(duì)多種化療藥物具有高耐受性。因此,深入理解膀胱癌化療耐受的分子機(jī)制至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控通路異常是其抵御化療藥物誘導(dǎo)殺傷效應(yīng)的重要手段之一。腫瘤細(xì)胞凋亡受多種因子調(diào)控,其中p53是影響腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控重要調(diào)控因子,p53通過調(diào)控凋亡相關(guān)靶基因表達(dá),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞凋亡。而p53在細(xì)胞內(nèi)受多種調(diào)控因子影響。其中,iASPP是p53的重要抑制因子,iASPP能結(jié)合并抑制p53對(duì)下游抗氧化靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,因此發(fā)揮原癌基因的作用。iASPP屬于ASPPs蛋白家族,大量研究顯示iASPP在多種腫瘤中高表達(dá),并與腫瘤化療耐受有關(guān),但iASPP調(diào)控腫瘤化療耐受的分子機(jī)制研究的不夠深入。此外,iASPP在膀胱癌中表達(dá)水平與作用未知,有待發(fā)掘。本文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)手段,證實(shí)iASPP m RNA水平與蛋白水平在膀胱癌組織和細(xì)胞中均顯著升高。隨后本文檢測(cè)細(xì)胞活力后發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞化療耐受與iASPP有關(guān)。通過外源過表達(dá)和RNAi干擾技術(shù),證實(shí)iASPP干擾后的細(xì)胞耐藥性下降,iASPP過表達(dá)則細(xì)胞耐藥性上升。本文進(jìn)一步利用細(xì)胞流式分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究iASPP增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞耐藥機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),iASPP通過抑制ROS水平來發(fā)揮細(xì)胞凋亡抑制的作用,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)iASPP抑制凋亡基因Bax m RNA表達(dá),促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2m RNA表達(dá)。進(jìn)一步通過核質(zhì)組分分離實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)iASPP主要定位于細(xì)胞質(zhì),且這些膀胱癌細(xì)胞中p53發(fā)生功能抑制性突變。本文為進(jìn)一步明確iASPP調(diào)控膀胱癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡等手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)iASPP提高Nrf2蛋白水平及其下游抗氧化靶基因表達(dá)(FTH1、HMO1、NQO1),但對(duì)Nrf2 m RNA以及Keap1蛋白水平?jīng)]有影響。綜上,本研究證實(shí)iASPP在膀胱癌中高表達(dá),并且可能以p53非依賴性方式,提高Nrf2蛋白水平,Nrf2抗氧化靶基因以及促凋亡Bax的表達(dá),抑制凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá),抑制ROS水平,抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐受。本研究將為膀胱癌耐藥機(jī)制研究提供新的思路。
【學(xué)位單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 課題來源及研究背景和意義
    1.2 國內(nèi)外在該方向的研究現(xiàn)狀及分析
        1.2.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.2 國內(nèi)外文獻(xiàn)綜述的簡(jiǎn)析
    1.3 主要研究?jī)?nèi)容
        1.3.1 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表達(dá)水平研究
        1.3.2 iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞化療耐藥的影響
        1.3.3 iASPP調(diào)控膀胱癌耐藥分子機(jī)制的研究
    1.4 技術(shù)路線圖
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟
        2.2.1 載體構(gòu)建
        2.2.2 質(zhì)粒提取
        2.2.3 細(xì)胞的復(fù)蘇
        2.2.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)
        2.2.5 細(xì)胞凍存
        2.2.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.2.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.9 MTT法測(cè)定細(xì)胞半致死率
        2.2.10 細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        2.2.12 細(xì)胞活性氧水平檢測(cè)
        2.2.13 免疫組化
第3章 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表達(dá)水平研究
    3.1 膀胱癌組織中iASPP表達(dá)水平研究
        3.1.1 免疫組化檢測(cè)iASPP蛋白水平
        3.1.2 組織免疫印跡檢測(cè)iASPP蛋白水平
        3.1.3 組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)iASPPmRNA水平
    3.2 膀胱癌細(xì)胞系中iASPP表達(dá)水平
        3.2.1 膀胱癌細(xì)胞中iASPPmRNA表達(dá)水平
        3.2.2 膀胱癌細(xì)胞中iASPP蛋白表達(dá)水平
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第4章 iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞化療耐藥的影響
    4.1 膀胱癌細(xì)胞化療藥物的耐受性
    4.2 內(nèi)源iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.1 iASPP過表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 內(nèi)源iASPP蛋白對(duì)5637細(xì)胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.3 內(nèi)源iASPP蛋白對(duì)T24細(xì)胞化療藥物耐受性的影響
        4.2.4 外源過表達(dá)iASPP蛋白對(duì)T24細(xì)胞化療藥物耐受性的影響
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
第5章 iASPP調(diào)控細(xì)胞耐藥分子機(jī)制的初步研究
    5.1 iASPP通過抑制膀胱癌細(xì)胞ROS而抑制細(xì)胞凋亡
        5.1.1 iASPP蛋白下調(diào)與外源過表達(dá)效率驗(yàn)證
        5.1.2 內(nèi)源iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡水平的影響
        5.1.3 外源過表達(dá)iASPP對(duì)T24細(xì)胞凋亡水平的影響
        5.1.4 iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞ROS水平的影響
        5.1.5 ROS對(duì)iASPP調(diào)控膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響
    5.2 iASPP可能以p53非依賴方式抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡
        5.2.1 膀胱癌T24、5637細(xì)胞p53基因均為突變型
        5.2.2 iASPP蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較多
    5.3 內(nèi)源iASPP對(duì)膀胱癌細(xì)胞Nrf2及下游靶基因的影響
    5.4 外源過表達(dá)iASPP對(duì)T24細(xì)胞Nrf2及下游靶基因的影響
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 羅楠;iASPP在慢性粒細(xì)胞白血病非BCR-ABL依賴型耐藥機(jī)制的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2865597