細(xì)胞內(nèi)存在數(shù)千種蛋白質(zhì)并構(gòu)成一種精細(xì)網(wǎng)絡(luò),它們在細(xì)胞中的相互作用受到嚴(yán)格控制,這種控制網(wǎng)絡(luò)的不平衡將導(dǎo)致各種遺傳疾病以及癌癥。癌癥可以從癌蛋白的穩(wěn)定化或者腫瘤抑制基因的不穩(wěn)定化發(fā)展而來。同時癌細(xì)胞能維持較高量的蛋白水解機制,并促進腫瘤抑制蛋白的降解或原癌基因的激活。因此,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UP-S)的研究對于腫瘤的治療將具有重要的意義,并且可能存在大量的潛在靶標(biāo)進行有針對性的干預(yù)治療。HRD1,也被稱為synoviolin,是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解的E3泛素連接酶。HRD1可以識別、泛素化靶標(biāo)蛋白參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑,清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯誤折疊蛋白,以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白穩(wěn)態(tài)。同時研究表明HRD1不僅可以泛素化錯誤折疊的蛋白介導(dǎo)它們的降解,同樣可以通過降解其它非折疊錯誤的蛋白進而參與到包括調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展等眾多的細(xì)胞生物學(xué)過程中。因此,研究HRD1及其潛在的靶標(biāo)蛋白對于了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制及開發(fā)潛在的腫瘤治療靶標(biāo)具有重要的研究意義。本研究分為兩個部分,第一部分探討了HRD1作為PTEN的E3泛素連接酶并通過蛋白酶體途徑的降解促進肝癌細(xì)胞增殖以及肝癌進展的分子機制的研究。第二部分主要探討了E3泛素連接酶HRD1,通過泛素化介導(dǎo)的降解影響肺癌細(xì)胞中SIRT2穩(wěn)定性,及HRD1-SIRT2相互作用對肺癌發(fā)生發(fā)展的影響。第一部分:HRD1介導(dǎo)的PTEN降解促進細(xì)胞增殖和肝癌進展PTEN是一種非常重要的抑癌基因,該基因的突變是許多癌癥發(fā)展的一個步驟。我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)HRD1是腫瘤抑制因子PTEN的互作蛋白之一,且已有的研究表明HRD1在肝癌中表達(dá)上調(diào),同時PTEN在肝癌中表達(dá)下調(diào),本研究驗證了HRD1與PTEN的相互作用,并進一步檢測了HRD1-PTEN相互作用在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用。主要研究結(jié)果如下:1.HRD1與PTEN相互作用并介導(dǎo)PTEN的泛素化及蛋白酶體途徑降解首先通過外源及內(nèi)源蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析驗證了HRD1與PTEN之間存在相互作用關(guān)系;進一步檢測出HRD1能夠正向調(diào)節(jié)PTEN的泛素化水平,HRD1的過表達(dá)能特異性增加PTEN蛋白的泛素化水平;此外,CHX示蹤實驗顯示,HRD1的過表達(dá)能顯著縮短PTEN蛋白的半衰期,肝癌細(xì)胞中HRD1的敲低則增加了PTEN的半衰期,且蛋白酶體抑制劑MG132處理的HRD1敲低的肝癌細(xì)胞中PTEN的蛋白水平的回復(fù),則表明HRD1能夠通過泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體途徑降解PTEN。2.HRD1-PTEN相互作用在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用我們篩選了穩(wěn)定敲低PTEN,穩(wěn)定敲低HRD1,以及穩(wěn)定敲低PTEN后再敲低HRD1的肝癌Hep3B及MHCC97H的細(xì)胞株,同時篩選了高表達(dá)PTEN,高表達(dá)HRD1,以及高表達(dá)PTEN同時高表達(dá)HRD1的肝癌Hep3B及MHCC97H的細(xì)胞株。利用MTS及克隆形成實驗檢測了HRD1-PTEN對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響,利用細(xì)胞劃痕實驗檢測了HRD1-PTEN對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響,以及利用Transwell實驗檢測了HRD1-PTEN對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,HRD1通過調(diào)節(jié)PTEN進而促進肝癌細(xì)胞的增殖,遷移及侵襲能力。同時利用裸鼠成瘤動物模型檢測了HRD1在體內(nèi)對肝癌發(fā)生的影響,結(jié)果顯示HRD1的缺失能夠抑制腫瘤的生長。進一步在人肝癌樣本中也顯示出HRD1與PTEN表達(dá)模式的負(fù)相關(guān)性。因此HRD1介導(dǎo)PTEN泛素化對肝癌發(fā)生發(fā)展具有一定的調(diào)控作用。第二部分:E3泛素連接酶HRD1,通過泛素化介導(dǎo)的降解影響肺癌細(xì)胞中SIRT2穩(wěn)定性已有的研究表明SIRT2與HRD1均在尤以帕金森病(PD)為代表的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的作用。SIRT2的研究大部分都集中在其本身的去乙酰化的功能,其翻譯后修飾的研究較少,同時越來越多的研究表明SIRT2同樣是一種腫瘤抑制因子,且在多種癌癥中下調(diào),基因表達(dá)譜的分析也顯示HRD1與SIRT2在肺癌中表達(dá)負(fù)相關(guān)。由此,我們推測SIRT2與HRD1應(yīng)該也存在著相應(yīng)的聯(lián)系,且可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的調(diào)節(jié)作用。本研究檢測了HRD1與SIRT2的相互作用關(guān)系,并進一步分析了HRD1-SIRT2在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.HRD1作為SIRT2的E3泛素連接酶促進SIRT2的降解通過外源及內(nèi)源蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析驗證了HRD1與SIRT2的相互作用;并通過進一步的泛素化實驗及CHX示蹤實驗表明HRD1能夠作為SIRT2的E3泛素連接酶介導(dǎo)其泛素化及蛋白酶體途徑的降解。2.HRD1-SIRT2相互作用在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用我們篩選了穩(wěn)定敲低SIRT2,穩(wěn)定敲低HRD1,以及穩(wěn)定敲低SIRT2后再敲低HRD1的肺癌A549及NCI-H446的細(xì)胞株,同時篩選了高表達(dá)SIRT2,高表達(dá)HRD1,以及高表達(dá)SIRT2同時高表達(dá)HRD1的肺癌A549及NCI-H446的細(xì)胞株。利用MTS及克隆形成實驗檢測了HRD1-SIRT2對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響,利用細(xì)胞劃痕實驗檢測了HRD1-SIRT2對肺癌細(xì)胞遷移能力的影響,以及利用Transwell實驗檢測了HRD1-SIRT2對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,HRD1通過調(diào)節(jié)SIRT2的蛋白水平進而促進肺癌細(xì)胞的增殖,遷移及侵襲能力。同時利用裸鼠成瘤動物模型檢測了HRD1在體內(nèi)對肺癌發(fā)生的影響,結(jié)果顯示HRD1的缺失能夠抑制腫瘤的生長,HRD1的異常表達(dá)則能夠顯著促進腫瘤的生長。進一步在人肺癌樣本中也顯示出HRD1與SIRT2表達(dá)模式的負(fù)相關(guān)性。3.藥物處理對SIRT2蛋白水平的影響我們篩選了13種藥物其中包括8種中藥分別處理肺癌A549細(xì)胞,結(jié)果顯示抗腫瘤藥物依托泊苷的處理能增加SIRT2的蛋白表達(dá)水平,同時降低HRD1的蛋白表達(dá)水平。同時HRD1的敲低使肺癌細(xì)胞對凋亡敏感,而SIRT2敲低降低了肺癌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性。因此HRD1-SIRT2的相互作用研究為肺癌的發(fā)生發(fā)展提供一定的分子機制參考,及為腫瘤治療提供可能的潛在靶標(biāo)。
【學(xué)位單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.2
【部分圖文】：

的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBC）（分子量約 14-16 kDa）。即便在不同的泛素結(jié)合酶 E2中這種泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域也有將近 35%的序列是相對保守的。泛素結(jié)合酶(E2)的主要作用是為泛素激活酶 E1s，泛素連接酶 E3s 和活化的 Ub 或 UBL 提供結(jié)合位點。UBL 是一種類泛素蛋白，如 SUMO，ISG15 和 NEDD8 等[25]，此類蛋白的功能是以類似于泛素化修飾的方式與目標(biāo)蛋白，從而有效的調(diào)節(jié)靶蛋白的活性。E2s 能特異性的選擇靶標(biāo)蛋白上的賴氨酸位點并使之與泛素分子共價結(jié)合，并且泛素鏈的連接方式及長度也均由泛素結(jié)合酶 E2s 特異性的決定，進而調(diào)控靶蛋白的降解。早期的研究還表明即便沒有泛素連接酶的 E3s 存在，泛素結(jié)合酶 E2s 也可以特異性的的催化靶標(biāo)蛋白泛素鏈的形成。③ 泛素連接酶(E3)泛素連接酶 E3 的多樣性及底物的多樣性決定了泛素連接酶 E3 對底物的特異性選擇�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)鑒定的泛素連接酶 E3 主要有四類：HECT，RING finger，U-bo以及 PHD 結(jié)構(gòu)域的 E3 泛素連接酶[26-31]如圖 1.2 所示。這 4 種形式的 E3 泛素連接酶中的每一種都是根據(jù)具有相似的催化機制進行分類，因此提供了獨特的靶向機會。

Raymond J Deshaies（2014）圖 1.3 26S 蛋白酶體的結(jié)構(gòu)Figure 1.3. Structure of the 26S proteasome.由 4 個同軸的環(huán)組成，每個環(huán)由 7 個亞基組外側(cè)的兩個環(huán)稱為 α 環(huán)，由 7 個 α 亞基組成由 7 個 β 亞基組成，其中 β、β2 和 βs 具有蘇具有 Caspase 樣肽酶活性，β2 具有胰蛋白酶[38, 40]。這些活性位點處于 20S 中心復(fù)合物內(nèi)白質(zhì)的降解。20S 核心復(fù)合物兩端可與三種調(diào)節(jié)復(fù)合物結(jié)合即構(gòu)成 26S 的蛋白酶體復(fù)合體體相結(jié)合。19S 調(diào)節(jié)復(fù)合物由 17 個不同亞基合物，另一個是蓋復(fù)合物。前者由 6 個 ATP 酶由 9 個亞基組成�；讖�(fù)合物中的 ATP 酶亞體降解腔通道的開啟，具有降解底物去折疊

正如伊馬替尼(imatinib)(GleeveceTM;GliveceTM)的病例中所ABL 融合癌蛋白的選擇性抑制劑用于治療慢性粒細(xì)胞白血病，BCR-A和過度擴增以及致病的依賴性喪失導(dǎo)致遺傳畸變都可能發(fā)生，這些的治療策略[55, 56]。對于 E3 泛素連接酶的抑制劑和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，不能排除類似的情況。事實上，最近有報道稱，熱休克蛋白 27使腫瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)(VelcadeTM)產(chǎn)生克蛋白 27 (Hsp27)的反義治療則在抗性細(xì)胞中恢復(fù)了對藥物的凋亡反體而言，特異性泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UP-S)抑制似乎是穩(wěn)定腫瘤生長常有前景的途徑。質(zhì)網(wǎng)壓力響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ERAD）是一種細(xì)胞生物學(xué)過程，其靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)白質(zhì)，并泛素化錯誤折疊蛋白質(zhì)隨后被稱為蛋白酶體的蛋白質(zhì)降解8-60]。ERAD 主要包括三個步驟：識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊或突變的蛋從 ER 向細(xì)胞基質(zhì)逆向轉(zhuǎn)運和泛素依賴性的蛋白酶體降解(圖 1.4)。
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本文編號：2865213