葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,Gox）作為一種新型飼用酶制劑,在畜禽生產(chǎn)上通過改善腸道環(huán)境、預(yù)防腸道感染和腹瀉,從而提高飼糧消化利用率,促進(jìn)其生長。優(yōu)良的飼用Gox應(yīng)具有良好的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的Gox酶突變體GoxM4為研究材料,利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行分子改良研究,獲得熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性顯著提高的突變體,并探究Gox的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性機(jī)理。采用計(jì)算機(jī)輔助的理性設(shè)計(jì)對GoxM4繼續(xù)進(jìn)行熱穩(wěn)定性改良研究。通過糖基化修飾、輔基FAD結(jié)合能優(yōu)化、疏水作用力引入和折疊自由能優(yōu)化等四種策略進(jìn)行迭代突變,獲得了累積5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)的突變體GoxM8（T31V/Q88R/S94A/T274F/Y278T）。GoxM8的熱穩(wěn)定性顯著提高,在80°C下處理2 min后的剩余酶活由GoxM4的40%提高到了80%。基于酶恒定剩余酶活A(yù)min與溫度之間的負(fù)相關(guān)性計(jì)算其Tm值,GoxM8較GoxM4提高了9.5○C。Gox M8的催化效率（kcat/Km值）較GoxM4提高了6.8%,分別為28.3 mM-1s-1和26.5 m M-1s-1。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)... 

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 葡萄糖氧化酶概述
        1.1.1 葡萄糖氧化酶的來源
        1.1.2 葡萄糖氧化酶的基本性質(zhì)
        1.1.3 葡萄糖氧化酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及催化機(jī)理
        1.1.4 葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)
        1.1.5 葡萄糖氧化酶的活性測定
        1.1.6 葡萄糖氧化酶的應(yīng)用前景
    1.2 葡萄糖氧化酶的分子改良研究進(jìn)展
    1.3 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及其分子改良
        1.3.1 非理性設(shè)計(jì)策略
        1.3.2 理性設(shè)計(jì)策略
    1.4 研究內(nèi)容與目的
第二章 葡萄糖氧化酶GoxM4的熱穩(wěn)定性改良研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 引物合成和測序
        2.1.3 生化試劑、試劑盒和工具酶
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基及試劑配制
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 Gox各突變體的異源表達(dá)
        2.2.3 GoxM4及其突變體酶學(xué)性質(zhì)測定
        2.2.4 GoxM4及其突變體的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 高通量平板篩選方法的建立
        2.3.2 GoxM4突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)
        2.3.3 GoxM4各突變體的篩選結(jié)果
        2.3.4 GoxM4及其突變體在搖床水平的表達(dá)和純化
        2.3.5 GoxM4及其突變體的熱穩(wěn)定參數(shù)的評估
        2.3.6 GoxM4及其突變體的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    2.4 討論
    本章小結(jié)
第三章 葡萄糖氧化酶GoxM8的酸穩(wěn)定性改良研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 引物合成和測序
        3.1.3 生化試劑、試劑盒和工具酶
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基及試劑配制
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 模擬GoxM8 在胃腸道環(huán)境中的p H穩(wěn)定性和活性
        3.2.2 GoxM8及其突變體的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 GoxM8及其突變體的異源表達(dá)
        3.2.4 GoxM8及各突變體酶學(xué)性質(zhì)測定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 GoxM8 在胃腸道環(huán)境中的pH穩(wěn)定性和活性的模擬結(jié)果
        3.3.2 GoxM8突變體的設(shè)計(jì)結(jié)果
        3.3.3 GoxM8突變體篩選結(jié)果
        3.3.4 GoxM8突變體搖床水平的表達(dá)和純化結(jié)果
        3.3.5 GoxM8突變體的酶學(xué)性質(zhì)鑒定
        3.3.6 GoxM8 突變體的pKa的計(jì)算結(jié)果
        3.3.7 GoxM8突變體的結(jié)構(gòu)分析
    3.4 討論
    本章小結(jié)
第四章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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