目的:斑蝥素(Cantharidin)是傳統(tǒng)中藥斑蝥的活性成分,我們前期研究已經(jīng)證實,斑蝥素在體外確實能顯著抑制胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移,但其在體內(nèi)的具體作用尚缺乏實驗研究。因此,本研究擬探討斑蝥素對體內(nèi)胰腺癌移植瘤生長的影響及其相關(guān)機制,為斑蝥素應(yīng)用于胰腺癌治療提供更加科學(xué)的理論基礎(chǔ)。方法:1、應(yīng)用裸鼠皮下及胰腺體尾部注射胰腺癌PANC-1細胞株懸液法制作裸鼠皮下及原位胰腺癌移植瘤模型。2、應(yīng)用裸鼠皮下及原位胰腺癌移植瘤模型,觀察斑蝥素對胰腺癌移植瘤生長的影響;并應(yīng)用Luminex技術(shù)檢測平均螢光強度。3、應(yīng)用免疫組化檢測胰腺癌移植瘤標(biāo)本中CD34蛋白的表達;根據(jù)C D34表達水平計算微血管密度(Microvessel density,MVD)。4、應(yīng)用Milliplex技術(shù)檢測經(jīng)斑蝥素處理后,PANC-1細胞培養(yǎng)液中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α細胞因子的水平。5、應(yīng)用Microarray、RNA-seq、Ray Bio antibody array分別檢測PANC-1細胞中目的基因在m RNA水平或蛋白質(zhì)水平的表達情況。6、應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測經(jīng)ERK、JNK、NF-κB、PKC通路抑制劑預(yù)處理后,斑蝥素對PANC-1細胞中目的基因表達的影響。7、應(yīng)用MTT檢測人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)、PKC通路抑制劑他莫昔芬(Tamoxifen)對PANC-1細胞增殖能力的影響。8、應(yīng)用裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型,觀察斑蝥素分別聯(lián)合PKC通路抑制劑他莫昔芬、抗血管生成藥物,包括人參皂苷Rg3、貝伐單抗(Bevacizumab)、阿帕替尼(Apatinib)、恩度(Endostar),對胰腺癌移植瘤生長的影響。9、應(yīng)用裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型,觀察斑蝥素衍生物分別聯(lián)合抗血管生成藥物貝伐單抗對胰腺癌移植瘤生長的影響。結(jié)果:1、斑蝥素處理組裸鼠皮下及原位胰腺癌移植瘤的體積、重量均明顯增大,螢光強度明顯增強,并且螢光峰值出現(xiàn)更早,衰減更快,移植瘤樣本中MVD也明顯升高,提示斑蝥素在體內(nèi)具有促進胰腺癌增殖的作用,且可能與誘導(dǎo)腫瘤血管生成相關(guān)。2、斑蝥素和岡田酸(Okadaic acid,OA)能顯著提高PANC-1細胞培養(yǎng)液中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α血管生成相關(guān)細胞因子的水平,并且可上調(diào)PANC-1細胞中血管生成相關(guān)基因IL-8/CXCL8、CXCL1/GRO-α、VEGF/VEGFA、GM-CSF/CSF2和PLAUR/u PAR在m RNA以及蛋白質(zhì)水平的表達。3、ERK、JNK、NF-κB、PKC信號通路抑制劑預(yù)處理PANC-1細胞后,可削弱斑蝥素上調(diào)促血管生成相關(guān)基因表達的作用,提示上述激酶通路可能參與了斑蝥素誘導(dǎo)的腫瘤血管重塑過程。4、人參皂苷Rg3、他莫昔芬在體外均對PANC-1細胞增殖具有抑制作用,且呈劑量-時間依賴性。5、斑蝥素分別聯(lián)合他莫昔芬、抗血管生成藥物(人參皂苷Rg3、貝伐單抗、阿帕替尼、恩度)治療荷瘤裸鼠,腫瘤體積、重量均較對照組明顯縮小,螢光強度亦下降,提示抗血管生成治療與PKC通路抑制劑可以拮抗斑蝥素的促生長作用,并呈現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用。6、斑蝥素衍生物分別聯(lián)合抗血管生成藥物貝伐單抗治療荷瘤裸鼠,腫瘤體積、重量均較對照組明顯縮小,螢光強度亦下降,進一步證實斑蝥素衍生物與抗血管生成治療在體內(nèi)亦具有協(xié)同抗腫瘤作用。結(jié)論:斑蝥素通過誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤微血管生成,促進胰腺癌的增殖,ERK、JNK、NF-κB、PKC激酶通路可能參與了斑蝥素誘導(dǎo)腫瘤血管重塑的過程。抗血管生成治療藥物與激酶通路抑制劑可以拮抗斑蝥素的促生長作用,并呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。上述結(jié)果提示,臨床應(yīng)用斑蝥素抗腫瘤應(yīng)在抗血管生成治療的前提下進行。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.9
【部分圖文】：

圖 1 斑蝥素促進裸鼠皮下胰腺癌移植瘤的生長斑蝥素（CAN）處理組與對照組裸鼠皮下胰腺癌移植瘤體積（A）與裸鼠體重（B）的變化活體動物可見光成像圖片（C）與螢光強度分析（D）；瘤體剝除后直觀圖（E）與腫瘤重量（F注：*表示與對照組比較 P < 0.05，**表示與對照組比較 P < 0.01。為了研究斑蝥素的這種體內(nèi)促生長作用是否與腫瘤類別相關(guān)，我們用同樣的方構(gòu)建了肺癌 NCI-H292 及腸癌 LoVo 的裸鼠皮下移植瘤模型。研究結(jié)果顯示，斑蝥處理組的腫瘤大小明顯較對照組大，腫瘤重量也明顯增加（圖 2A-B 肺癌，C-D 腸癌）這說明斑蝥素同樣可以促進肺癌及腸癌皮下移植瘤的生長，并且其促生長作用與腫類別無關(guān)。

圖 1 斑蝥素促進裸鼠皮下胰腺癌移植瘤的生長斑蝥素（CAN）處理組與對照組裸鼠皮下胰腺癌移植瘤體積（A）與裸鼠體重（B）的變化；活體動物可見光成像圖片（C）與螢光強度分析（D）；瘤體剝除后直觀圖（E）與腫瘤重量（F）。注：*表示與對照組比較 P < 0.05，**表示與對照組比較 P < 0.01。為了研究斑蝥素的這種體內(nèi)促生長作用是否與腫瘤類別相關(guān)，我們用同樣的方法構(gòu)建了肺癌 NCI-H292 及腸癌 LoVo 的裸鼠皮下移植瘤模型。研究結(jié)果顯示，斑蝥素處理組的腫瘤大小明顯較對照組大，腫瘤重量也明顯增加（圖 2A-B 肺癌，C-D 腸癌），這說明斑蝥素同樣可以促進肺癌及腸癌皮下移植瘤的生長，并且其促生長作用與腫瘤類別無關(guān)。

斑蝥素與抗血管生成治療在胰腺癌中的協(xié)同抗腫瘤作用 結(jié) 果二、斑蝥素促進裸鼠原位胰腺癌移植瘤的生長同樣地，在裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型中我們也得到了一致的結(jié)果。在給藥 13天后，斑蝥素處理組的裸鼠體重開始呈下降趨勢；給藥 19 天后，兩組裸鼠體重出現(xiàn)明顯差異（圖 3A）。活體動物體內(nèi)可見光成像系統(tǒng)也清楚地呈現(xiàn)了兩組裸鼠胰腺原位移植瘤情況（圖 3B）。通過分析瘤體的螢光強度，我們也得出斑蝥素處理組原位腫瘤的螢光強度明顯高于對照組的結(jié)論（圖 3C）。圖 3D-E 也直觀地呈現(xiàn)了兩組裸鼠胰腺原位腫瘤的大小和重量。我們可以看到，斑蝥素處理組胰腺原位剝除下來的腫瘤無論外形上還是重量上，均較對照組明顯增大。上述結(jié)果提示，斑蝥素也可以促進裸鼠原位胰腺癌移植瘤的生長。
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本文編號：2864464