發(fā)布時間：2020-10-31 17:51

　　 目的:建立一種新型方法用于提高PIK3CA基因(H1047R位點(diǎn))突變檢測敏感度。方法:通過亞克隆技術(shù)構(gòu)建PIK3CA基因野生型DNA模板(含BseJI酶切位點(diǎn))和突變型DNA模板。將PIK3CA基因野生型模板與突變型模板按照野生突變比(W:T)=100:1,300:1,1000:1的比例混合,并在高保真pfu DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得第一輪PCR產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶BseJI將PCR產(chǎn)物酶切消化1h后過柱純化,以2μl酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,過程中每10個循環(huán)加入BseJI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化1h,最后對其產(chǎn)物進(jìn)行測序。結(jié)果:我們成功地構(gòu)建帶有PIK3CA基因H1047R突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒模板及其相應(yīng)的野生型質(zhì)粒模板。由于野生型片段包含限制性內(nèi)切酶BseJI的酶切位點(diǎn),在反應(yīng)過程中,PCR擴(kuò)增與反復(fù)的酶切消化聯(lián)合作用能夠選擇性地擴(kuò)增突變片段,而野生片段的擴(kuò)增則受到抑制。在眾多檢測PIK3CA基因H1047R位點(diǎn)突變的方法中,與敏感性介于5:1-10:1的眾多檢測方法相比,該方法的敏感性可達(dá)1000:1,因而能夠有效提高突變檢測敏感度。結(jié)論:通過高保真DNA聚合酶、低溫限制性內(nèi)切酶、特異性引物等現(xiàn)有的技術(shù)材料,建立一種對PIK3CA基因H1047R這一熱點(diǎn)突變高效、快速的檢測方法,為腫瘤患者的早期診斷、個體化治療及預(yù)后判斷提供幫助。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R730.43
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
實驗材料
實驗方法
研究結(jié)果
討論
結(jié)論
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綜述
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本文編號：2864297