研究背景及研究目的:作為“基因組看護者(genomic gatekeeper)”,p53是在機體內(nèi)的表達水平受到精密而嚴格的調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn)p53基因在約50%的腫瘤組織中是突變的,而在剩下的50%具有野生型p53的腫瘤中,其活性因受到其它癌基因的抑制使得p53的表達始終維持在一個較低的水平。MDM2除了作為p53最主要的負調(diào)控因子之外,同時還是p53下游轉(zhuǎn)錄激活的靶基因之一,因此,MDM2和p53之間形成了一個負反饋環(huán)路。近年來有研究結果發(fā)現(xiàn)一系列細胞刺激和調(diào)控因子能通過抑制MDM2-p53反饋環(huán)路,激活p53蛋白的表達,進而抑制腫瘤細胞的惡性進展,例如p19~(ARF)等。核糖體蛋白(Ribosomal Proteins,RPs)-MDM2-p53信號軸是新近發(fā)現(xiàn)的能影響p53活性的一條新通路。核糖體RNA(ribosome rRNA,rRNA)的合成受阻或剪切異常、核糖體蛋白和某些核仁蛋白的功能失調(diào)、核糖體亞基的組裝異常以及化學藥物刺激等都會破壞核糖體的生物合成過程,產(chǎn)生“核糖體刺激”(也稱作“核仁刺激”,ribosomal stress或nucleolar stress)。一旦發(fā)生核糖體刺激,將會導致一系列核糖體蛋白(RPs),例如RPL5、RPL11、RPL23、RPLS7和RPS14等,從細胞核仁轉(zhuǎn)位至細胞核漿并與MDM2結合,進而阻斷其對p53的E3泛素化降解作用,以維持細胞穩(wěn)態(tài)。既往研究已經(jīng)鑒定了一些能調(diào)控RPs-MDM2-p53信號軸的上游分子,例如PICT1能抑制RPL11的活性調(diào)控MDM2-p53信號通路,SRSF1能與RPL5-MDM2形成復合物穩(wěn)定p53的表達,但是否還存在其他分子介導RPL5-MDM2-p53信號通路的活性尚不清楚。SPIN1(Spindlin 1)能否通過負調(diào)控p53信號通路促進腫瘤細胞增殖是本項研究的論證重點,本研究將從分子生物學、細胞生物學、臨床標本及生物信息學等多角度進行探索和驗證,試圖闡明SPIN1調(diào)控p53蛋白表達及活性的分子機制,并證明SPIN1在調(diào)控腫瘤細胞惡性增殖過程中的重要作用及靶點價值。本研究的開展將有助于深入闡明腫瘤細胞惡性增殖的分子機理,有望為腫瘤患者的靶向治療提供新方向。研究方法:第一部分:鑒定SPIN1是能與RPL5相互作用的蛋白1、RPL5-MDM2-p53信號軸是一種重要的能維持機體穩(wěn)態(tài)的細胞防御機制,可有效地防止由異常的致癌活性引起的細胞生長失控。為了尋找介導此信號通路活性的上游調(diào)控分子,本課題組前期成功構建過表達RPL5的穩(wěn)定細胞系,采用免疫共沉淀-質(zhì)譜分析實驗(IP-MS)探索可能與RPL5相互作用的蛋白分子,其中SPIN1引起了我們課題組的關注。2、為了證實SPIN1與RPL5能否互相作用,本課題組首先利用基因克隆技術成功構建了Myc-SPIN1、Flag-RPL5、Flag-SPIN1及GFP-RPL5等質(zhì)粒,通過免疫共沉淀實驗(Co-IP)分別檢測SPIN1和RPL5外源性和內(nèi)源性條件下的結合情況。3、為了理解SPIN1和RPL5相互作用的分子機制,我們分別構建了帶有GST標簽的GST-SPIN1的全長及截斷片段、GST-RPL5的全長及截斷片段,并在細菌中純化His-SPIN1和His-RPL5,采用GST pull down實驗證實SPIN1和RPL5能否直接結合,并確定兩者的結合位點。第二部分:SPIN1促進腫瘤細胞增殖的作用及機制研究1、為研究SPIN1對p53的調(diào)控作用,利用siRNA分別干擾p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和結腸癌HCT116細胞中SPIN1的表達,采用Western blotting和實時定量PCR(qRT-PCR)檢測細胞中干擾SPIN1的表達后p53及其下游靶基因表達的變化。2、為了研究SPIN1在腫瘤細胞增殖過程中所起到的作用并驗證其作用是否依賴于調(diào)控p53的表達,我們成功構建了干擾SPIN1表達的shRNA質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染至p53野生型和p53缺失型結腸癌細胞(HCT116~(p53+/+)和HCT116~(p53-/-))中,采用CCK-8、克隆形成實驗及流式細胞儀凋亡分析等評價SPIN1對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響;并采用Western blotting檢測在HCT116細胞中檢測干擾SPIN1對p53及其下游靶基因p21及PUMA的蛋白表達的影響。3、為進一步明確SPIN1對腫瘤細胞增殖能力的影響是否依賴于p53信號通路,利用慢病毒感染技術建立了穩(wěn)定干擾SPIN1的結腸癌HCT116細胞株(HCT116~(p53+/+)-scramble shRNA、HCT116~(p53+/+)-SPIN1 shRNA、HCT116~(p53-/-)-scramble shRNA和HCT116~(p53-/-)-SPIN1 shRNA),同時建立腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型,觀察移植瘤在體內(nèi)的生長情況,并采用Western blotting和qRT-PCR檢測瘤體組織中p53信號通路的變化。4、收集新鮮術后結腸癌標本和正常結腸組織標本,采用Western blotting驗證SPIN1在結腸癌組織中的表達是否升高,并采用網(wǎng)絡平臺Oncomine等數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)分析SPIN1在多種腫瘤中的表達情況。第三部分:SPIN1負調(diào)控p53蛋白穩(wěn)定性的功能及機制探討1、為進一步研究SPIN1如何調(diào)控p53的蛋白表達,我們采用CHX(cycloheximide,放線菌酮)追蹤實驗檢測調(diào)控SPIN1的表達對p53蛋白半衰期的影響,利用體內(nèi)泛素化等一系列實驗觀察過表達SPIN1對MDM2介導的p53泛素化降解作用的影響,并在p53和MDM2雙重缺失的MEF ~(p53-/-;MDM2-/-)細胞中轉(zhuǎn)染過表達SPIN1和p53的質(zhì)粒,驗證SPIN1對p53的調(diào)控作用是否依賴于MDM2。2、為確定SPIN1是否通過抑制RPL5-MDM2相互作用進而調(diào)控p53蛋白活性,我們采用免疫共沉淀(Co-IP)實驗檢測過表達SPIN1對RPL5-MDM2結合情況的影響,采用免疫熒光實驗驗證SPIN1和RPL5的共定位情況。3、采用Ribosome profiling(核糖體質(zhì)譜分析)、免疫共沉淀(Co-IP)及qRT-PCR等一系列實驗驗證干擾SPIN1的表達能否通過抑制rRNA生成誘發(fā)核糖體刺激,增加游離狀態(tài)的核糖體蛋白RPL5/RPL11與MDM2的結合,進而激活p53的蛋白表達及轉(zhuǎn)錄活性。結果:第一部分:鑒定SPIN1是能與RPL5相互作用的蛋白1、免疫共沉淀質(zhì)譜(IP-MS)分析方法發(fā)現(xiàn)了一批能與RPL5結合的蛋白,有一些已經(jīng)被證實可與RPL5結合并能調(diào)控p53活性,其中,SPIN1因其與rRNA生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關被選為我們進一步的實驗對象。2、本項目采用免疫共沉淀(Co-IP)實驗證實SPIN1能和RPL5特異性地外源性結合,卻不能和其它核糖體蛋白RPL11及RPL23相互結合;此外,我們還發(fā)現(xiàn)SPIN1能特異性地與RPL5內(nèi)源性結合。3、GST pull down實驗的結果發(fā)現(xiàn)SPIN1和RPL5能特異性地相互直接結合,且SPIN1可通過其第二個Tudor結構域與RPL5結合,而SPIN1能特異性地結合RPL5的N端和C端。第二部分:SPIN1促進腫瘤細胞增殖的作用及機制研究1、在p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和結腸癌HCT116細胞中,干擾SPIN1會顯著增加p53及其下游靶基因p21、MDM2及PUMA的蛋白表達;此外,在HCT116細胞中干擾SPIN1會顯著增加p21及PUMA的mRNA表達水平,過表達SPIN1則會產(chǎn)生相反的效應,但不論是沉默還是過表達SPIN1,對p53本身的mRNA表達無影響。2、干擾SPIN1的表達能顯著抑制結腸癌HCT116細胞的增殖活性及平板細胞克隆形成能力,加快細胞凋亡,且對HCT116 ~(p53+/+)細胞的作用比HCT116 ~(p53-/-)細胞更加顯著。3、裸鼠模型進一步證實沉默SPIN1能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長能力,相應的,Western blotting和qRT-PCR實驗證實沉默SPIN1的表達主要通過激活p53蛋白及其下游靶基因PUMA等的表達抑制瘤體的生長增殖能力,但SPIN1仍具有非p53依賴性的促腫瘤細胞惡性增殖的能力。4、臨床標本分析顯示SPIN1在結腸癌組織中的表達顯著高于正常結腸組織,網(wǎng)絡平臺Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析結果證實SPIN1在多種腫瘤中均出現(xiàn)不同程度的高表達,例如胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等。第三部分:SPIN1負調(diào)控p53蛋白穩(wěn)定性的功能及機制探討1、CHX實驗證實干擾SPIN1的表達能顯著延長p53蛋白的半衰期,而過表達SPIN1則能縮短p53蛋白的半衰期;體內(nèi)泛素化實驗的結果顯示過表達SPIN1能促進MDM2介導的p53泛素化降解作用,且這種作用呈劑量依賴性;此外,在p53和MDM2雙重缺失的小鼠成纖維細胞MEF ~(p53-/-;MDM2-/-)中,過表達SPIN1不能改變外源性表達的p53蛋白的表達水平,因此SPIN1對p53的降解抑制作用是依賴于MDM2的。2、免疫共沉淀(Co-IP)實驗的結果證實過表達SPIN1能呈劑量依賴性地特異性地抑制RPL5-MDM2的外源性結合作用,對RPL11-MDM2的相互作用無影響;此外激光共聚焦實驗技術的結果顯示SPIN1和RPL5能共定位于細胞核仁結構。3、qRT-PCR的結果發(fā)現(xiàn)干擾SPIN1會抑制r RNA的生成,并且Ribosome profiling的結果證實沉默SPIN1能誘發(fā)核糖體刺激,增加游離狀態(tài)的RPL5和RPL11的表達,促進內(nèi)源性RPL5/RPL11-MDM2相互作用,激活p53的蛋白表達;此外,不論是干擾RPL5還是RPL11都會阻斷沉默SPIN1對p53的激活作用,證實這些游離狀態(tài)的核糖體蛋白RPL5/RPL11在SPIN1對p53的負調(diào)控作用過程中起著重要的作用。結論:1、SPIN1是能與RPL5特異性地直接結合的蛋白分子,且SPIN1可通過其Tudor 2結構域與RPL5結合,而SPIN1能特異性地結合RPL5的N端和C端;2、細胞功能學及體內(nèi)裸鼠實驗證實干擾SPIN1的表達能通過激活p53信號通路顯著抑制結腸癌腫瘤細胞的惡性增殖能力;臨床樣本驗證發(fā)現(xiàn)SPIN1在結腸癌組織中的表達顯著升高,數(shù)據(jù)庫分析提示SPIN1在多種腫瘤中均有不同程度的高表達;3、SPIN1負調(diào)控p53蛋白表達及活性促腫瘤生成發(fā)展的分子機制主要有兩部分:一方面SPIN1將RPL5限制于核仁,減少RPL5與MDM2的結合,促進MDM2對p53的泛素化降解;另一方面,干擾SPIN1能通過誘發(fā)核糖體刺激,釋放游離狀態(tài)的核糖體蛋白RPL5/RPL11與MDM2結合,穩(wěn)定p53蛋白。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R730.2
【部分圖文】：

圖 1. 誘導 p53 激活的應激反應于文獻修改：Regulation of the p53 response and its relationship to cancer. Biochem2015）往研究已證實 MDM2-p53 反饋環(huán)路在調(diào)控腫瘤細胞增殖和分化的過程

圖 1-1 HEK293 細胞蛋白質(zhì)免疫共沉淀 SDS-PAGE 圖譜（考馬斯亮藍染色）左：蛋白分子量大小；右：質(zhì)譜鑒定出的部分蛋白 質(zhì)譜分析差異表達條帶將以上差異表達的 18 個條帶進行質(zhì)譜分析，驗證了一些既往報道能與 R作用（SRSF1）或能調(diào)控 p53 活性的蛋白分子（MYBBP1A，PRMT5 既往文獻報道 SPIN1 與 rRNA 的生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，結合學分析，本課題組初步擬定 SPIN1（Spindlin 1）為下一步的研究對象

分別用 anti-Myc 和 anti-Flag 的抗體進行 Westernblotting 檢測，如圖所示（圖1-2-A 和圖 1-2-B），用 Flag 標簽抗體能將 Flag-RPL5 和 Myc-SPIN1 同時沉淀下來，結果證實 RPL5 能特異性地結合 SPIN1。此外，我們還轉(zhuǎn)染了 GFP-RPL5 和 Flag-SPIN1 至 HCT116p53-/-細胞中，采用與上相似的實驗方法進行了免疫共沉淀實驗。研究結果發(fā)現(xiàn)采用 Flag 標簽抗體能將 Flag-SPIN1 及 GFP-RPL5 同時沉淀下來，證實 SPIN1 也能特異性地結合RPL5（如圖 1-2-C 所示）。為了進一步驗證 SPIN1 是否能和 RPL5 內(nèi)源性結合，我們提取 HEK293 細胞的蛋白進行了免疫共沉淀分析。將細胞裂解液用 SPIN1的抗體進行孵育，再分別用 anti-SPIN1、anti-RPL5 和 anti-RPL11 的抗體進行Westernblotting 檢測
【參考文獻】

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1 岳文,孫麗亞,李春海,張立新,裴雪濤;卵巢癌相關基因的篩選與鑒定[J];癌癥;2004年02期

本文編號：2863517