研究背景及研究目的:作為“基因組看護(hù)者(genomic gatekeeper)”,p53是在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平受到精密而嚴(yán)格的調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn)p53基因在約50%的腫瘤組織中是突變的,而在剩下的50%具有野生型p53的腫瘤中,其活性因受到其它癌基因的抑制使得p53的表達(dá)始終維持在一個(gè)較低的水平。MDM2除了作為p53最主要的負(fù)調(diào)控因子之外,同時(shí)還是p53下游轉(zhuǎn)錄激活的靶基因之一,因此,MDM2和p53之間形成了一個(gè)負(fù)反饋環(huán)路。近年來有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一系列細(xì)胞刺激和調(diào)控因子能通過抑制MDM2-p53反饋環(huán)路,激活p53蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展,例如p19~(ARF)等。核糖體蛋白(Ribosomal Proteins,RPs)-MDM2-p53信號(hào)軸是新近發(fā)現(xiàn)的能影響p53活性的一條新通路。核糖體RNA(ribosome rRNA,rRNA)的合成受阻或剪切異常、核糖體蛋白和某些核仁蛋白的功能失調(diào)、核糖體亞基的組裝異常以及化學(xué)藥物刺激等都會(huì)破壞核糖體的生物合成過程,產(chǎn)生“核糖體刺激”(也稱作“核仁刺激”,ribosomal stress或nucleolar stress)。一旦發(fā)生核糖體刺激,將會(huì)導(dǎo)致一系列核糖體蛋白(RPs),例如RPL5、RPL11、RPL23、RPLS7和RPS14等,從細(xì)胞核仁轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核漿并與MDM2結(jié)合,進(jìn)而阻斷其對(duì)p53的E3泛素化降解作用,以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。既往研究已經(jīng)鑒定了一些能調(diào)控RPs-MDM2-p53信號(hào)軸的上游分子,例如PICT1能抑制RPL11的活性調(diào)控MDM2-p53信號(hào)通路,SRSF1能與RPL5-MDM2形成復(fù)合物穩(wěn)定p53的表達(dá),但是否還存在其他分子介導(dǎo)RPL5-MDM2-p53信號(hào)通路的活性尚不清楚。SPIN1(Spindlin 1)能否通過負(fù)調(diào)控p53信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖是本項(xiàng)研究的論證重點(diǎn),本研究將從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、臨床標(biāo)本及生物信息學(xué)等多角度進(jìn)行探索和驗(yàn)證,試圖闡明SPIN1調(diào)控p53蛋白表達(dá)及活性的分子機(jī)制,并證明SPIN1在調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性增殖過程中的重要作用及靶點(diǎn)價(jià)值。本研究的開展將有助于深入闡明腫瘤細(xì)胞惡性增殖的分子機(jī)理,有望為腫瘤患者的靶向治療提供新方向。研究方法:第一部分:鑒定SPIN1是能與RPL5相互作用的蛋白1、RPL5-MDM2-p53信號(hào)軸是一種重要的能維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞防御機(jī)制,可有效地防止由異常的致癌活性引起的細(xì)胞生長(zhǎng)失控。為了尋找介導(dǎo)此信號(hào)通路活性的上游調(diào)控分子,本課題組前期成功構(gòu)建過表達(dá)RPL5的穩(wěn)定細(xì)胞系,采用免疫共沉淀-質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)(IP-MS)探索可能與RPL5相互作用的蛋白分子,其中SPIN1引起了我們課題組的關(guān)注。2、為了證實(shí)SPIN1與RPL5能否互相作用,本課題組首先利用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了Myc-SPIN1、Flag-RPL5、Flag-SPIN1及GFP-RPL5等質(zhì)粒,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)分別檢測(cè)SPIN1和RPL5外源性和內(nèi)源性條件下的結(jié)合情況。3、為了理解SPIN1和RPL5相互作用的分子機(jī)制,我們分別構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的GST-SPIN1的全長(zhǎng)及截?cái)嗥�、GST-RPL5的全長(zhǎng)及截?cái)嗥?并在細(xì)菌中純化His-SPIN1和His-RPL5,采用GST pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPIN1和RPL5能否直接結(jié)合,并確定兩者的結(jié)合位點(diǎn)。第二部分:SPIN1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究1、為研究SPIN1對(duì)p53的調(diào)控作用,利用siRNA分別干擾p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中SPIN1的表達(dá),采用Western blotting和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中干擾SPIN1的表達(dá)后p53及其下游靶基因表達(dá)的變化。2、為了研究SPIN1在腫瘤細(xì)胞增殖過程中所起到的作用并驗(yàn)證其作用是否依賴于調(diào)控p53的表達(dá),我們成功構(gòu)建了干擾SPIN1表達(dá)的shRNA質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染至p53野生型和p53缺失型結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116~(p53+/+)和HCT116~(p53-/-))中,采用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀凋亡分析等評(píng)價(jià)SPIN1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響;并采用Western blotting檢測(cè)在HCT116細(xì)胞中檢測(cè)干擾SPIN1對(duì)p53及其下游靶基因p21及PUMA的蛋白表達(dá)的影響。3、為進(jìn)一步明確SPIN1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響是否依賴于p53信號(hào)通路,利用慢病毒感染技術(shù)建立了穩(wěn)定干擾SPIN1的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株(HCT116~(p53+/+)-scramble shRNA、HCT116~(p53+/+)-SPIN1 shRNA、HCT116~(p53-/-)-scramble shRNA和HCT116~(p53-/-)-SPIN1 shRNA),同時(shí)建立腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型,觀察移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況,并采用Western blotting和qRT-PCR檢測(cè)瘤體組織中p53信號(hào)通路的變化。4、收集新鮮術(shù)后結(jié)腸癌標(biāo)本和正常結(jié)腸組織標(biāo)本,采用Western blotting驗(yàn)證SPIN1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)是否升高,并采用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)Oncomine等數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)分析SPIN1在多種腫瘤中的表達(dá)情況。第三部分:SPIN1負(fù)調(diào)控p53蛋白穩(wěn)定性的功能及機(jī)制探討1、為進(jìn)一步研究SPIN1如何調(diào)控p53的蛋白表達(dá),我們采用CHX(cycloheximide,放線菌酮)追蹤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)調(diào)控SPIN1的表達(dá)對(duì)p53蛋白半衰期的影響,利用體內(nèi)泛素化等一系列實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)SPIN1對(duì)MDM2介導(dǎo)的p53泛素化降解作用的影響,并在p53和MDM2雙重缺失的MEF ~(p53-/-;MDM2-/-)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)SPIN1和p53的質(zhì)粒,驗(yàn)證SPIN1對(duì)p53的調(diào)控作用是否依賴于MDM2。2、為確定SPIN1是否通過抑制RPL5-MDM2相互作用進(jìn)而調(diào)控p53蛋白活性,我們采用免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)SPIN1對(duì)RPL5-MDM2結(jié)合情況的影響,采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPIN1和RPL5的共定位情況。3、采用Ribosome profiling(核糖體質(zhì)譜分析)、免疫共沉淀(Co-IP)及qRT-PCR等一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾SPIN1的表達(dá)能否通過抑制rRNA生成誘發(fā)核糖體刺激,增加游離狀態(tài)的核糖體蛋白R(shí)PL5/RPL11與MDM2的結(jié)合,進(jìn)而激活p53的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果:第一部分:鑒定SPIN1是能與RPL5相互作用的蛋白1、免疫共沉淀質(zhì)譜(IP-MS)分析方法發(fā)現(xiàn)了一批能與RPL5結(jié)合的蛋白,有一些已經(jīng)被證實(shí)可與RPL5結(jié)合并能調(diào)控p53活性,其中,SPIN1因其與rRNA生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)被選為我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2、本項(xiàng)目采用免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPIN1能和RPL5特異性地外源性結(jié)合,卻不能和其它核糖體蛋白R(shí)PL11及RPL23相互結(jié)合;此外,我們還發(fā)現(xiàn)SPIN1能特異性地與RPL5內(nèi)源性結(jié)合。3、GST pull down實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPIN1和RPL5能特異性地相互直接結(jié)合,且SPIN1可通過其第二個(gè)Tudor結(jié)構(gòu)域與RPL5結(jié)合,而SPIN1能特異性地結(jié)合RPL5的N端和C端。第二部分:SPIN1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究1、在p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中,干擾SPIN1會(huì)顯著增加p53及其下游靶基因p21、MDM2及PUMA的蛋白表達(dá);此外,在HCT116細(xì)胞中干擾SPIN1會(huì)顯著增加p21及PUMA的mRNA表達(dá)水平,過表達(dá)SPIN1則會(huì)產(chǎn)生相反的效應(yīng),但不論是沉默還是過表達(dá)SPIN1,對(duì)p53本身的mRNA表達(dá)無影響。2、干擾SPIN1的表達(dá)能顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖活性及平板細(xì)胞克隆形成能力,加快細(xì)胞凋亡,且對(duì)HCT116 ~(p53+/+)細(xì)胞的作用比HCT116 ~(p53-/-)細(xì)胞更加顯著。3、裸鼠模型進(jìn)一步證實(shí)沉默SPIN1能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)能力,相應(yīng)的,Western blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默SPIN1的表達(dá)主要通過激活p53蛋白及其下游靶基因PUMA等的表達(dá)抑制瘤體的生長(zhǎng)增殖能力,但SPIN1仍具有非p53依賴性的促腫瘤細(xì)胞惡性增殖的能力。4、臨床標(biāo)本分析顯示SPIN1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸組織,網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果證實(shí)SPIN1在多種腫瘤中均出現(xiàn)不同程度的高表達(dá),例如胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等。第三部分:SPIN1負(fù)調(diào)控p53蛋白穩(wěn)定性的功能及機(jī)制探討1、CHX實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SPIN1的表達(dá)能顯著延長(zhǎng)p53蛋白的半衰期,而過表達(dá)SPIN1則能縮短p53蛋白的半衰期;體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示過表達(dá)SPIN1能促進(jìn)MDM2介導(dǎo)的p53泛素化降解作用,且這種作用呈劑量依賴性;此外,在p53和MDM2雙重缺失的小鼠成纖維細(xì)胞MEF ~(p53-/-;MDM2-/-)中,過表達(dá)SPIN1不能改變外源性表達(dá)的p53蛋白的表達(dá)水平,因此SPIN1對(duì)p53的降解抑制作用是依賴于MDM2的。2、免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)過表達(dá)SPIN1能呈劑量依賴性地特異性地抑制RPL5-MDM2的外源性結(jié)合作用,對(duì)RPL11-MDM2的相互作用無影響;此外激光共聚焦實(shí)驗(yàn)技術(shù)的結(jié)果顯示SPIN1和RPL5能共定位于細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)。3、qRT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾SPIN1會(huì)抑制r RNA的生成,并且Ribosome profiling的結(jié)果證實(shí)沉默SPIN1能誘發(fā)核糖體刺激,增加游離狀態(tài)的RPL5和RPL11的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)源性RPL5/RPL11-MDM2相互作用,激活p53的蛋白表達(dá);此外,不論是干擾RPL5還是RPL11都會(huì)阻斷沉默SPIN1對(duì)p53的激活作用,證實(shí)這些游離狀態(tài)的核糖體蛋白R(shí)PL5/RPL11在SPIN1對(duì)p53的負(fù)調(diào)控作用過程中起著重要的作用。結(jié)論:1、SPIN1是能與RPL5特異性地直接結(jié)合的蛋白分子,且SPIN1可通過其Tudor 2結(jié)構(gòu)域與RPL5結(jié)合,而SPIN1能特異性地結(jié)合RPL5的N端和C端;2、細(xì)胞功能學(xué)及體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SPIN1的表達(dá)能通過激活p53信號(hào)通路顯著抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的惡性增殖能力;臨床樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SPIN1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著升高,數(shù)據(jù)庫分析提示SPIN1在多種腫瘤中均有不同程度的高表達(dá);3、SPIN1負(fù)調(diào)控p53蛋白表達(dá)及活性促腫瘤生成發(fā)展的分子機(jī)制主要有兩部分:一方面SPIN1將RPL5限制于核仁,減少RPL5與MDM2的結(jié)合,促進(jìn)MDM2對(duì)p53的泛素化降解;另一方面,干擾SPIN1能通過誘發(fā)核糖體刺激,釋放游離狀態(tài)的核糖體蛋白R(shí)PL5/RPL11與MDM2結(jié)合,穩(wěn)定p53蛋白。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.2
【部分圖文】：

圖 1. 誘導(dǎo) p53 激活的應(yīng)激反應(yīng)于文獻(xiàn)修改：Regulation of the p53 response and its relationship to cancer. Biochem2015）往研究已證實(shí) MDM2-p53 反饋環(huán)路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和分化的過程

圖 1-1 HEK293 細(xì)胞蛋白質(zhì)免疫共沉淀 SDS-PAGE 圖譜（考馬斯亮藍(lán)染色）左：蛋白分子量大��；右：質(zhì)譜鑒定出的部分蛋白 質(zhì)譜分析差異表達(dá)條帶將以上差異表達(dá)的 18 個(gè)條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，驗(yàn)證了一些既往報(bào)道能與 R作用（SRSF1）或能調(diào)控 p53 活性的蛋白分子（MYBBP1A，PRMT5 既往文獻(xiàn)報(bào)道 SPIN1 與 rRNA 的生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，結(jié)合學(xué)分析，本課題組初步擬定 SPIN1（Spindlin 1）為下一步的研究對(duì)象

分別用 anti-Myc 和 anti-Flag 的抗體進(jìn)行 Westernblotting 檢測(cè)，如圖所示（圖1-2-A 和圖 1-2-B），用 Flag 標(biāo)簽抗體能將 Flag-RPL5 和 Myc-SPIN1 同時(shí)沉淀下來，結(jié)果證實(shí) RPL5 能特異性地結(jié)合 SPIN1。此外，我們還轉(zhuǎn)染了 GFP-RPL5 和 Flag-SPIN1 至 HCT116p53-/-細(xì)胞中，采用與上相似的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用 Flag 標(biāo)簽抗體能將 Flag-SPIN1 及 GFP-RPL5 同時(shí)沉淀下來，證實(shí) SPIN1 也能特異性地結(jié)合RPL5（如圖 1-2-C 所示）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 SPIN1 是否能和 RPL5 內(nèi)源性結(jié)合，我們提取 HEK293 細(xì)胞的蛋白進(jìn)行了免疫共沉淀分析。將細(xì)胞裂解液用 SPIN1的抗體進(jìn)行孵育，再分別用 anti-SPIN1、anti-RPL5 和 anti-RPL11 的抗體進(jìn)行Westernblotting 檢測(cè)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 岳文,孫麗亞,李春海,張立新,裴雪濤;卵巢癌相關(guān)基因的篩選與鑒定[J];癌癥;2004年02期

本文編號(hào)：2863517