胃癌是最常見的惡性腫瘤,盡管它在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈下降趨勢,但其死亡率仍高居不下。臨床運用了大量常規(guī)與靶向治療,但多數(shù)胃癌病人被確診時已出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,探究與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要信號通路及傳導(dǎo)機制,將有利于胃癌的早期診斷及靶向治療。Notch信號通路在遺傳進化上十分保守,在細胞分化增殖、凋亡和干細胞的自我更新等方面發(fā)揮了重要作用。研究顯示,它與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、低生存率及不良預(yù)后等密切相關(guān)。近年來,大量研究證實它在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程中也發(fā)揮了重要作用。Notch信號通路在相鄰細胞間發(fā)揮作用,不需要第二信使的參與。當Notch受體與鄰近細胞膜上配體Jagged1結(jié)合而被激活后,釋放Notch受體的胞內(nèi)區(qū)域(Notch intracellular domain,NICD),后者繼而轉(zhuǎn)位于細胞核中,與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相互作用,激活Notch通路的下游靶基因。EMT是上皮來源的惡性腫瘤表達惡性行為的重要方式,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。其特征為:上皮細胞間連接被破壞,失去細胞極性,上皮細胞表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型。除此之外,EMT過程最重要的改變是,它使腫瘤細胞獲得更強的運動能力。上皮性標志基因E-cadherin的缺失是EMT事件的標志性變化,間質(zhì)性標志基因有Vimentin、N-cadherin等,可通過檢測這些標記基因的表達水平來驗證EMT的發(fā)生。研究表明,在腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以刺激血管生成、促進細胞外基質(zhì)沉積并增加蛋白水解酶的合成。TGF-β1在細胞分化、增殖、凋亡及運動能力等方面發(fā)揮重要作用。它在各種病理條件下大量表達,如慢性炎癥和腫瘤。多方研究證實,腫瘤微環(huán)境的改變?nèi)缛毖趸騎GF-β1增高,可以誘發(fā)多種類型的上皮細胞發(fā)生EMT。目前,Notch信號在胃癌上皮間質(zhì)中的作用尚未闡明,探討其中的作用機制,或?qū)⒂幸嬗谖赴┑脑\療。目的采用熒光定量PCR實驗(Real time-PCR)、免疫印跡實驗(Western Blot)和Transwell侵襲實驗檢測在空白對照組、誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組中Jagged1、N1ICD、E-cadherin和Vimentin等基因的表達量,以及處理前后細胞侵襲性的變化,初步探討Notch信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌EMT中的作用及其對細胞侵襲性的影響。材料和方法1研究對象選擇胃癌細胞株SGC7901,使用RPMI 1640和FBS按9:1配置的完全培養(yǎng)基,將細胞置于37℃、5%CO_2的恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。2方法待細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底約80%時,將其隨機分為四組,即空白對照組、誘導(dǎo)組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組。其中,空白對照組不做任何處理,誘導(dǎo)組采用濃度為10ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細胞24h,轉(zhuǎn)染組瞬時轉(zhuǎn)染Jagged1的siRNA,陰性對照組轉(zhuǎn)染無義siRNA序列,轉(zhuǎn)染組和陰性對照組轉(zhuǎn)染48h后再用10ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)細胞24h。采用Real time PCR實驗檢測各組中E-cadherin、Vimentin及Jagged1 mRNA的表達水平,用Western Blot實驗檢測各組中E-cadherin、Vimentin、Jagged1及N1ICD蛋白的表達水平。Transwell侵襲實驗用于檢測各組中細胞侵襲能力的變化。3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析,用?x±s表述定量資料數(shù)據(jù),兩組間比較采用t檢驗,多組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析,以α=0.05為檢驗水準。結(jié)果1 TGF-β1誘導(dǎo)后對SGC7901細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響Western Blot結(jié)果表明,誘導(dǎo)組E-cadherin的蛋白表達量為0.15±0.12,較空白對照組的0.54±0.09顯著下降;誘導(dǎo)組Vimentin的蛋白表達量為0.81±0.20,較空白對照組的0.58±0.08顯著上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2 TGF-β1誘導(dǎo)后對SGC7901細胞Jagged1和N1ICD表達的影響2.1 TGF-β1誘導(dǎo)后對SGC7901細胞Jagged1 mRNA的相對表達水平的影響TGF-β1誘導(dǎo)處理后,熒光定量PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組Jagged1 mRNA的相對表達水平為1.59±0.20,與空白對照組相比,誘導(dǎo)組Jagged1的mRNA表達水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.2 TGF-β1誘導(dǎo)后對SGC7901細胞Jagged1和N1ICD蛋白的表達量的影響用Western Blot檢測Jagged1和N1ICD的蛋白表達水平結(jié)果表明,空白對照組Jagged1的蛋白相對表達量為0.36±0.22,誘導(dǎo)組為0.61±0.20,與空白對照組相比,誘導(dǎo)組Jagged1蛋白的表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);誘導(dǎo)組N1ICD的蛋白表達水平為0.74±0.19,較空白對照組(0.30±0.18)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3轉(zhuǎn)染Jagged1 siRNA并誘導(dǎo)處理后對SGC7901細胞N1ICD、E-cadherin和Vimentin表達的影響3.1轉(zhuǎn)染Jagged1 siRNA并誘導(dǎo)處理后對細胞E-cadherin和Vimentin mRNA表達的影響對SGC7901細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染Jagged1的siRNA后再用TGF-β1誘導(dǎo)處理,用熒光定量PCR技術(shù)檢測Jagged1、E-cadherin和Vimentin mRNA的相對表達水平。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組Jagged1的mRNA相對表達水平為0.61±0.04,較陰性對照組(1.48±0.03)、誘導(dǎo)組(1.36±0.18)和空白對照組(1.00±0.00)顯著降低;轉(zhuǎn)染組中E-cadherin的mRNA相對表達量為1.64±0.03,較陰性對照組(0.38±0.12)、誘導(dǎo)組(0.40±0.39)和空白對照組(1.00±0.00)升高,轉(zhuǎn)染組中Vimentin mRNA相對表達量為0.43±0.28,較陰性對照組(1.67±0.04)、誘導(dǎo)組(1.61±0.03)和空白對照組(1.00±0.00)降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2轉(zhuǎn)染Jagged1 siRNA并誘導(dǎo)處理后對SGC7901細胞N1ICD、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響用Western Blot檢測N1ICD、E-cadherin和Vimentin的蛋白表達情況,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染組N1ICD的蛋白表達水平為0.22±0.12,較陰性對照組(0.79±0.30)、誘導(dǎo)組(0.77±0.19)和空白對照組(0.41±0.21)下降;轉(zhuǎn)染組E-cadherin的蛋白表達水平為0.95±0.19,較陰性對照組(0.15±0.27)、誘導(dǎo)組(0.18±0.13)和空白對照組(0.47±0.02)升高;轉(zhuǎn)染組Vimentin的蛋白表達量為0.21±0.32,較陰性對照組(0.82±0.19)、誘導(dǎo)組(0.79±0.26)和空白對照組(0.54±0.04)下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4各處理組SGC7901細胞侵襲能力的改變采用Transwell侵襲實驗檢測各組胃癌SGC7901細胞侵襲能力的變化。TGF-β1誘導(dǎo)后發(fā)生侵襲的細胞數(shù)為74.67±2.60,空白對照組為55.0±2.65,誘導(dǎo)組侵襲的細胞數(shù)高于對照組,兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染組中侵襲細胞數(shù)目為36.33±4.73,陰性對照組為77.33±3.79,與陰性對照組和空白對照組相比,轉(zhuǎn)染組的發(fā)生侵襲的細胞數(shù)明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論TGF-β_1可能通過上調(diào)Notch信號通路而誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生EMT,并增強胃癌細胞的侵襲能力,提示Notch信號通路可能在胃癌侵襲方面發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

F-β1 誘導(dǎo)處理細胞 24h 后，采用 的蛋白表達水平，結(jié)果表明：誘導(dǎo)下降，誘導(dǎo)組 Vimentin 的蛋白表學(xué)意義(P<0.05)，(見表 3.1 和圖 3誘導(dǎo)胃癌 SGC7901 細胞發(fā)生了 E導(dǎo)后細胞 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白N E-cadherin 9 0.54 ± 0.09 9 0.15 ±0.12* 14.274 <0.001 ：*表示與空白對照組相比，P<0.05。

1 誘導(dǎo)后對 SGC7901 細胞 Jagged1 和 N1ICD1 誘導(dǎo)后對 SGC7901 細胞 Jagged1 mRNA 相對表達ml 的 TGF-β1 誘導(dǎo)細胞 24h 后，熒光定量 PCR 結(jié)A 的相對表達水平為 1.59±0.20，與空白對照組相比，水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，(見表 3.2.2 TGF-β1 誘導(dǎo)后細胞 Jagged1 mRNA 的相對表達情況( 注：*表示與空白對照組相比，P<0.05。組別 N Jagged1 mRNA空白對照組 9 1.00±0.00誘導(dǎo)組 9 1.59±0.20*t -29.175P <0.001

誘導(dǎo)組 Jagged1 的蛋白表達的蛋白表達水平分別為0.30±0.18，0.7對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(PICD 分子水平的表達升高表明 TGF-β1相互作用。-β1 誘導(dǎo)后細胞 Jagged1 和 N1ICD 的蛋白表N Jagged1 N1ICD9 0.36±0.22 0.30±09 0.61±0.20* 0.74±0-7.646 -10.40.002 <0.0注：*表示與空白對照組相比，（P<0.05）。
【參考文獻】

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本文編號：2864172