研究背景和目的:在腫瘤微環(huán)境中,巨噬細(xì)胞會受到肺癌細(xì)胞及其細(xì)胞因子的影響而發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞的功能十分復(fù)雜,具有抗癌和促癌兩種截然相反的功能。抗癌主要表現(xiàn)在巨噬細(xì)胞發(fā)揮M1型巨噬細(xì)胞吞噬和釋放抑癌因子的作用、發(fā)揮抗原呈遞作用并引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)等。促癌主要表現(xiàn)在抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)、錯誤修復(fù)受損組織并促進(jìn)血管生成的作用和保護(hù)腫瘤干細(xì)胞的作用等。巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能與代謝物質(zhì)基礎(chǔ)改變密切相關(guān),其中代謝物發(fā)揮著反應(yīng)底物和信號通路激活的作用。本研究旨在利用質(zhì)譜分析技術(shù)獲得肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞中具有明顯變化的特征代謝物,并結(jié)合相關(guān)生物學(xué)技術(shù)獲得巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)參數(shù)的佐證。材料與方法:研究中選取多種肺癌相關(guān)的細(xì)胞系(腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、鱗癌細(xì)胞系H157和末分化大細(xì)胞系H460),收集培養(yǎng)后的上清液,并配置成混合培養(yǎng)基來模擬肺癌微環(huán)境對單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7(M0型巨噬細(xì)胞)進(jìn)行刺激,并設(shè)置肺組織正常上皮細(xì)胞BEAS-2B培養(yǎng)上清液刺激的巨噬細(xì)胞作為正常對照組和DMEM合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞作為空白對照組。用含20%、50%和80%培養(yǎng)上清液的混合培養(yǎng)基對M0型巨噬細(xì)胞分別進(jìn)行24h、48h和72h培養(yǎng),采用單核/巨噬細(xì)胞熒光抗體CD14、M1型巨噬細(xì)胞熒光抗體CD16/32和M2型巨噬細(xì)胞熒光抗體CD206標(biāo)記巨噬細(xì)胞,并利用流式細(xì)胞儀檢測;為了更深入的探究肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對巨噬細(xì)胞的影響,設(shè)置加入M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑(脂多糖和十?dāng)_素γ)的平行實驗組,以含80%培養(yǎng)上清液的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48h后,使用CD16/32進(jìn)行標(biāo)記并作流式細(xì)胞儀檢測,采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力和采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒測定腫瘤壞死因子α濃度。每一種不同處理的巨噬細(xì)胞分別在帶有玻片的三個培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)48h后對每個巨噬細(xì)胞爬片采集三張譜圖。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離作為離子化方式,高分辨質(zhì)譜9.4 T apex-ultraTM hybrid Qh-FTICR MS在負(fù)離子采集模式(m/z400處分辨率為530,000)下對巨噬細(xì)胞爬片進(jìn)行原位膜脂檢測。采用代謝組學(xué)分析網(wǎng)站(MetaboAnalyst 3.0,http://www.metaboanalyst.ca/)對質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析和層次聚類分析,并對檢測到的近300個件謝物進(jìn)行搜庫鑒定和二級譜分析。研究結(jié)果:1)流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同肺相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液能夠抑制MO型巨噬細(xì)胞表面膜蛋白CD16/32的表達(dá),并且隨著濃度的上升和刺激時間的增加,抑制程度增強,并且Ml型巨噬細(xì)胞表面膜蛋白CD16/32被抑制的程度不同;2)CCK-8細(xì)胞活性檢測方法測定巨噬細(xì)胞的活性,發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)上清液均能夠增強巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力(P0.01),并且在DMEM培養(yǎng)基中的M1型巨噬細(xì)胞活力要強于M0型巨噬細(xì)胞(p0.01)。在某些培養(yǎng)上清液刺激下,M0和M1型巨噬細(xì)胞兩者細(xì)胞活力差異不明顯(p0.05);3)酶聯(lián)免疫吸附測定方法測定巨噬細(xì)胞受到上清液刺激后釋放腫瘤壞死因子α到培養(yǎng)基中的濃度,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液能夠促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞分泌大量腫瘤壞死因子α(p0.01)發(fā)揮抑癌作用,但是對M1型巨噬細(xì)胞卻沒有顯著影響(p0.05)。而在同一種培養(yǎng)上清液刺激下,M0型巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α釋放量顯著高于M1型巨噬細(xì)胞(p0.01);4)使用高分辨率質(zhì)譜檢測到近300種小分子代謝物,通過偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)PE-Cer(d36:1)與微環(huán)境的變化顯著相關(guān),并將影響最大的30種代謝物納入層次聚類分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞的定向誘導(dǎo)劑(脂多糖和干擾素γ)對巨噬細(xì)胞膜脂的影響與不同肺相關(guān)細(xì)胞系培養(yǎng)上清液的刺激存在顯著差異。通過層次聚類線發(fā)現(xiàn),在使用正常肺組織細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激后,M0型巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)含量比例與DMEM合成培養(yǎng)基中的M0型巨噬細(xì)胞比較接近,而M1型巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)含量比例則與受到肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激后的M1型巨噬細(xì)胞比較接近。研究結(jié)論:不同肺癌微環(huán)境對巨噬細(xì)胞有不同影響。M0型和M1型巨噬細(xì)胞本身質(zhì)膜的差異大于上清液刺激的影響,并發(fā)現(xiàn)變化顯著的標(biāo)志物DE-Cer(d36:1);不同肺癌微環(huán)境中膜蛋白CD16/32表達(dá)受到抑制,但巨噬細(xì)胞的活力增強;不同肺癌微環(huán)境中腫瘤壞死因子α被M0型巨噬細(xì)胞大量釋放,但M1型巨噬細(xì)胞沒有顯著的變化。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

ｏｐｅｕｉｕｍｅｕｙ，ｉｖ丄／ｔ＾伙�。辏海簦妫�?ｉｖｉｉ?生?ｔ±Ｈ坐ｌ?�。海守３�?ｙ?＾乃寸?＾?Ｔｗ?ｉｖｉｚ??型巨噬細(xì)胞（白介素４誘導(dǎo)）的全細(xì)胞質(zhì)譜圖（Ｗｈｏｌｅ－Ｃｅｌｌ?Ｓｐｅｃｔｒａ），所檢測的??對象為２－１２?ｋＤａ的多肽段。如圖１－１所示，Ｍｌ型巨噻細(xì)胞和Ｍ２型巨噻細(xì)胞在??多肽水平＃在顯著差異。從圖中可以看出Ｍｌ型巨噻細(xì)胞與未處埋的巨嗤細(xì)胞相??比在ｍ／ｚ?４９６５處的明顯豐度下降，而Ｍ２型巨噬細(xì)胞與未處理的巨噬細(xì)胞相比??少１３個多肽質(zhì)譜峰。??§?＿ｐＮ：ｖ?ｒ，?一?—…－??＾?－Ｉ?ｉｆ?ｌ?ｌ?Ｉ?ｌｒ?１?＊?ｆ?－Ｊ?Ｉ??°：?１?ｎ?Ｆ￣￣＾和?４－』ｉ?￣￣Ｍｎ－??？?ｆ?＾?Ｉ?１??？?？?４．ＮＳ??ｃ?????｜?〇?ｈＩｌ＾?＾?ｎ??－紀(jì)一?，，＾?＾?，?１１?ｆ?５?ｉ?ｆ?１１?ｌｉ?．?Ｉ?Ｉ??Ｈ?§?Ｍ１?ｉ＊§?＇ｉ?ｉ?ｌ?－ｉｉｉ?ｉ?！??？?－ＮＳ??＾＿＿??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??２０００?４０００?６０００?８０００?１００００?ｔ２０００??ｍ／ｚ??圖１－１．巨噬細(xì)胞的ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ檢測譜圖。紅色質(zhì)譜峰代表僅能夠在受到刺??激的巨噬細(xì)胞中被檢測到，綠色質(zhì)譜峰代表僅能夠在未受到刺激巨噬細(xì)胞中被檢??測到。ＮＳ：指未刺激的巨噬細(xì)胞。（Ｒｉｃｈａｒｄ?Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ?ｅｔ．?ａｌ

?、一ｉ＊?＿ＣＤ?山?ＡＡ?ＸＰ＊＇?七?Ａ＾ｒ?白??＾、ｊ?ｈ＝＾巫ｊｍｍ?ｈ社ｌｔｒｊ恨測，服妙狀ｔ守ｈ±Ｈ巫ｉ、ｉ口」土似ｉ子；ａ々王＊ｒ?ｔｒｊ蟲ｈ?１?ｓ思??（圖１－２）。２０１５年時他們則對不同外形的巨噬細(xì)胞，即圓形和紡錘形巨噬細(xì)胞??進(jìn)行了蛋白組的檢測，發(fā)現(xiàn)紡錘形巨噬細(xì)胞中有特異性的２７種蛋白，而圓形巨??噻細(xì)胞則是有１１個，共有９４個，其中圓形巨噬細(xì)胞１７個蛋白相比紡錘形巨嗤??細(xì)胞局表達(dá)，而紡錘形巨嗤細(xì)胞則是１個。??ｃｅｌｌ?ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ?ｃｙｌｏｓｋｅｌｅｔｏｎ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ??ａｎｄ?５。廣陽?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｃ；ｅｉｎ?ｍ〇ｄｉｆｉｃａｔｏｎ??ｓｉｇｎａｌ?ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?＇?ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ?ａｎｄ?ｅｎｅｒｇｙ?ｑ?４〇，－??１．３％?０．８％??ｏｒｇａｎｅｌｌｅ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ａｒ＞ｄ．?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ?１．３％??ｃｅｉｌ?ｃｙｃｌｅ??ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｔｏ?０．４％??ｅｘｔｅｒｎａｌ?ｓｔｉｍｕｌｕｓ??１－７％?ｗＳＳｍｍｓＬ．

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本文編號：2860222