目的:乳腺癌的耐藥性是臨床復發(fā)和轉(zhuǎn)移致死的主要原因,近年來的報道認為乳腺癌耐藥性與細胞自噬密切相關(guān),但其詳細的分子機制不甚清楚。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NUPR1(亦稱為nuclear protein 1,p8或Com 1)在腫瘤中的生物學功能引起了研究人員們的廣泛關(guān)注,但關(guān)于NUPR1在乳腺癌細胞耐藥性方面的功能還未見報道。本課題的研究目的是深入探究耐受三苯氧胺的乳腺癌細胞中NUPR1的生物學功能,闡明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NUPR1如何通過調(diào)控細胞自噬途徑介導三苯氧胺耐藥性的分子機制,并在臨床樣品中驗證;同時探討基于NUPR1生物學效應(yīng)而進行的改善乳腺癌細胞耐藥性的可行性,即NUPR1潛在的臨床應(yīng)用價值。此項研究結(jié)果將有助于了解乳腺癌中細胞自噬調(diào)控途徑,豐富人們對產(chǎn)生乳腺癌耐藥性的分子機制認識。方法:本項研究由三部分組成。第一部分,NUPR1在乳腺癌患者中的表達情況及乳腺癌細胞在產(chǎn)生耐藥性過程中的自噬水平變化。利用免疫組織化學染色檢測評估133例乳腺癌患者的組織樣本中NUPR1的表達量以及分布變化,進一步統(tǒng)計分析組織芯片中NUPR1與患者生存期的關(guān)系。通過RT-PCR與Western blot的實驗手段檢測人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A與多種乳腺癌細胞系及其相應(yīng)的已產(chǎn)生耐藥性的多種乳腺癌細胞系中NUPR1的表達水平。Western blot檢測自噬標志蛋白SQSTM1、LC3B的表達量變化,揭示自噬流的動態(tài)變化水平,并利用自噬抑制劑bafilomycin A1(BafA1)和chloroquine(CQ)干預自噬途徑,通過BrdU細胞增殖實驗檢測細胞增殖變化。第二部分:NUPR1在介導乳腺癌細胞產(chǎn)生耐藥性過程中的生物學功能。利用shRNA在耐藥性的乳腺癌細胞系MCF-7、T47D中下調(diào)NUPR1后,使用光學顯微鏡和透射電子顯微鏡分別觀察細胞的形態(tài)學變化和細胞的超微結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定表達mCherry-GFP-LC3質(zhì)粒以及Lyso-Tracker Red和mono dansylcadaverine(MDC)染色檢測自噬流量的變化。通過Western blot檢測自噬相關(guān)途徑標志蛋白的表達水平差異,隨后進行流式細胞儀細胞周期檢測實驗、BrdU細胞增殖實驗、細胞克隆形成能力實驗、細胞侵襲能力實驗、β-gal檢測細胞衰亡標記分子變化實驗和雌性裸鼠乳腺注射成瘤的體內(nèi)實驗等檢測下調(diào)NUPR1后耐藥性細胞發(fā)生的一系列生物學功能改變。第三部分:NUPR1干預自噬途徑產(chǎn)生耐藥性的機制。首先通過免疫沉淀、質(zhì)譜鑒定分析NUPR1在維持細胞耐藥性中的復合物,即相互作用的蛋白。其次將未處理的、三苯氧胺處理后耐藥性的、以及產(chǎn)生耐藥性后再下調(diào)NUPR1的乳腺癌細胞系MCF7提取總RNA,進行轉(zhuǎn)錄組測序,隨后比較轉(zhuǎn)錄組基因表達差異。通過ChIP-re-ChIP,Luciferase和EMSA實驗等驗證NUPR1直接調(diào)控的下游基因。結(jié)果:第一部分研究結(jié)果顯示:人乳腺癌組織芯片的免疫組織化學染色結(jié)果顯示NUPR1在人乳腺癌組織中較癌旁組織高表達,且主要富集在細胞核中;高表達NUPR1的乳腺癌患者具有較短的生存期(P0.005)。進一步分析得知NUPR1的表達與臨床分期和年齡密切相關(guān)(P0.005)。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示,NUPR1在細胞中表達量隨著藥物處理時間的延長不斷升高,且已產(chǎn)生耐藥性的細胞持續(xù)高表達NUPR1。同時,處理過程中自噬標記分子的表達變化揭示著耐藥性細胞整體的自噬流量上升。BrdU細胞增殖實驗表明干擾自噬流量顯著影響了耐藥性細胞的增殖水平。第二部分研究結(jié)果顯示:下調(diào)NUPR1后,細胞出現(xiàn)變大變扁平的形態(tài),并隨時間的推移逐漸死亡,β-gal檢測顯示是通過細胞衰亡途徑死亡的;Lyso-Tracker Red染色為陽性,揭示著細胞內(nèi)為酸性環(huán)境;綜合mCherry-GFP-LC3實驗和Western blot檢測自噬標志蛋白結(jié)果表明自噬溶酶體的降解途徑受阻;透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)大量的溶酶體以及自噬溶酶體。NUPR1下調(diào)后的細胞惡性程度在體內(nèi)外實驗中顯著下降,表現(xiàn)為細胞增殖能力、侵襲能力和克隆形成能力下降,小鼠體內(nèi)成瘤率和腫瘤體積均顯著小于對照組。第三部分研究結(jié)果顯示:分析未處理的、三苯氧胺處理后耐藥性的、以及產(chǎn)生耐藥性后再下調(diào)NUPR1的乳腺癌細胞系MCF7的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果后,發(fā)現(xiàn)溶酶體、細胞周期和雌激素等信號途徑中的諸多基因轉(zhuǎn)錄水平改變,例如BECN1、LCN2、RAB31和NEDD9等。利用ChIP-re-ChIP實驗驗證NUPR1、ESR1在BECN1基因啟動子區(qū)上明顯富集。Luciferase實驗結(jié)果顯示,下調(diào)NUPR1后促進BENC1基因的轉(zhuǎn)錄活性,去除ESR1的結(jié)合位點后,削弱了對BECN1的抑制性作用。進一步EMSA體外實驗結(jié)果表明,NUPR1可以與BECN1基因的啟動子區(qū)域結(jié)合。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、NUPR1 在乳腺癌的表達及耐藥性產(chǎn)生過程中的自噬變化性（P > 0.05）。采用 Kaplan-Meier 方法繪制患者的總生存曲線圖，同時用 LogRank 檢驗分析得出如圖 1.1 E 所示結(jié)果，NUPR1 的表達水平與乳腺癌患者的生存預后密切相關(guān)，低表達 NUPR1 的乳腺癌患者具有較長的生存期，提示著NUPR1 可作為不良預后的檢測。

27圖 1.2.2 三苯氧胺耐藥性產(chǎn)生過程中乳腺癌細胞的自噬變化。A, 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測 0.4μM 三苯氧胺處理的細胞中 LC3B 和 SQSTM1 的蛋白表達變化,ACTB 蛋白為對照。B, 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測 ATG5、ATG7 在細胞中被下調(diào)表達的效率，同時檢測下調(diào) ATG5、ATG7 后，細胞中 LC3B 和 SQSTM1 的表達水平。C,BrdU 細胞增殖實驗檢測在母代細胞和耐藥性細胞中下調(diào) ATG5、ATG7后細胞的增殖變化水平。D, 在母代細胞和耐藥性細胞中加入自噬抑制劑 BafA1或 CQ 處理細胞 10 小時后，Westernblotting 實驗檢測 LC3B 和 SQSTM1 的表達量變化。E,BrdU 細胞增殖實驗檢測在母代細胞和耐藥性細胞中加入自噬抑制劑BafA1 或 CQ 處理細胞 10 小時后的細胞增殖水平差異。

文 二、NUPR1 在介導乳腺癌細胞耐藥性中的生物學功能45圖2.2.1 下調(diào)NUPR1 后導致自噬溶酶體的降解途徑受阻。A，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測三條NUPR1shRNA 的敲低效率，ACTB 蛋白作為對照。B，在各個細胞系中，檢測NUPR1、LC3B 和SQSTM1 的蛋白水平變化，以ACTB 為參考值。C, MCF-7、MCF-7TamR shRNA con 和 NUPR1 shRNA 細胞的透射電子顯微鏡圖。（注：箭頭所指為細胞中的溶酶體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)；N 代表細胞核；M 指示線粒體）D，Lyso-Tracker Red 和 MDC 染色結(jié)果的熒光圖，比例尺 10 μm。Western blot 檢測 LC3B 和SQSTM1 的蛋白量變化，ACTB 蛋白為對照（下圖）。E
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本文編號：2857885