在我國(guó)肝癌是一種高致死率的惡性疾病,它的預(yù)防與治療一直是解決的重點(diǎn)與難點(diǎn)。從自然界中尋找出一種天然無(wú)毒副作用的抗腫瘤藥物成了關(guān)注的熱點(diǎn)。本課題組前期研究了從黑豆皮中提取、分離與純化花青素成分的不同方法與最佳條件。但黑豆皮中花青素(Black soybean coats anthocyanins,BSCA)所含成分類型,及相關(guān)性質(zhì)與作用機(jī)制還需深入探討。為了進(jìn)一步探究黑豆皮中花青素(BSCA)的抗氧化性能與其抑制肝癌的分子機(jī)制,本文主要通過(guò)以下內(nèi)容展開:1.通過(guò)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)BSCA進(jìn)行檢測(cè)分析,并與多種標(biāo)品出峰時(shí)間比較得出所提BSCA的主要成分有四種,分別是飛燕草素葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素葡萄糖苷和矢車菊素。將不同濃度的BSCA作用于細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶指標(biāo)、MDA指標(biāo)以及ROS變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSCA促使SOD、CAT、GSH-Px等指標(biāo)升高,而降低了MDA及ROS的水平,表明BSCA具有良好抗氧化性能。2.采用MTT和EDU法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè),篩選經(jīng)BSCA處理后抑制效果最明顯的細(xì)胞株,結(jié)果顯示BSCA抑制肝癌Hep G2細(xì)胞的效果最為顯著,且呈相應(yīng)的時(shí)間-劑量相關(guān)性。用不同濃度的BSCA分別作用于細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞核的變化情況。結(jié)果表明,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)BSCA作用后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯皺縮,間隙增大,數(shù)量減少;細(xì)胞核發(fā)生皺縮,成月牙狀。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BSCA作用細(xì)胞后,引起了線粒體膜電位的降低。3.用不同濃度的BSCA處理Hep G2細(xì)胞與SMMC7721細(xì)胞后,使用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路中的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3的蛋白水平以及基因水平的表達(dá)情況加以檢測(cè),同時(shí)使用Western Blot方法檢測(cè)了凋亡途徑中相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53、p63等的表達(dá)情況。結(jié)果表明p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)量均隨作用濃度及時(shí)間的增加而降低,p53、p63的表達(dá)量逐漸升高。由此得出,BSCA能促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)受到了一定程度的抑制。另外,對(duì)JAK2采取shRNA干擾后,JAK2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),再將BSCA作用于shJAK2細(xì)胞株后,結(jié)果顯示出BSCA對(duì)shJAK2細(xì)胞中JAK2表達(dá)的抑制效果更為明顯。由此得出BSCA可通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路致使肝癌Hep G2、SMMC7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述結(jié)果為研發(fā)天然無(wú)毒副作用的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù),也為抗癌的靶向治療研究提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖 1.1 JAK2/STAT3 信號(hào)通路途徑Fig 1.1 JAK2/STAT3 signaling pathway1.2.2 JAK2/STAT3 信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡JAK2（蛋白酪氨酸激酶 2）/STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子）信號(hào)途種人類癌細(xì)胞的生存、增殖與代謝方面顯露出特別關(guān)鍵的效能[26-28]。JAK2 是子受體信號(hào)傳輸?shù)闹匾盘?hào)因子[29]，若其收到刺激而活化后，JAK2 激酶就STAT3，STAT3 級(jí)聯(lián)的下游目標(biāo)也被激活，發(fā)揮各自特有的功效，受 STAT3之基因皆和促癌生長(zhǎng)、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移等高度相關(guān)，如 BcL-2、Cyclin D1、c-Myc等，超常活性的 STAT3 可引發(fā)這些下游的目標(biāo)基因過(guò)度表達(dá)，促使癌細(xì)胞的展[30-32]。STAT3 又為磷酸化的 JAK2 首選之下游靶基因，并在多種腫瘤細(xì)胞中活，保持活躍態(tài)，擁有原癌基因潛能，即致癌作用，以及抗凋亡活性[33,34]。于斷 STAT3 上游之激活因子 JAK2 或制止 STAT3 本身發(fā)生磷酸化成為了一種潛效抗癌策略。據(jù)了解，已研發(fā)多種 JAK2 的抑制劑，其中 AG490 是首個(gè) JA制劑。通過(guò)抑制 JAK2 的活性和誘導(dǎo)凋亡，選擇性地抑制癌細(xì)胞的體內(nèi)外生

黑豆皮花青素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及分子機(jī)理研究.4 結(jié)果與分析.4.1 BSCA 成分分析與鑒定前期已通過(guò)探究得知最佳提取方法及相關(guān)提取優(yōu)化條件。本研究將用 D101脂純化后的 BSCA 進(jìn)行 HPLC 分析其所含成分及含量，并與標(biāo)準(zhǔn)品參照比對(duì)出黑豆皮中花青素所含成分分別是（1）飛燕草素葡萄糖苷（D3G）占 6.7%、車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）占 64%、（3）矮牽牛素葡萄糖苷（Pt3G）占 34）矢車菊素（Cy）占 20.5%。結(jié)果如 Fig. 2.1 所示。其中所含主要的花青素 C3G，含量為 10.02 mg/g。

14圖 2.3 黑豆皮花青素對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響Fig. 2.3 Effects of anthocyanins from black soybean coats on ROS in Hep G2 cells andSMMC7721 cells. （A、B）The level of ROS was detected and analyzed by Flow cytometry inhepatoma cells.Cells were treated with 150 μg/mL BSCA for indicated times ,upon each experimentalgroup stained with DCFH-DA, and analyzed by Flow cytometry.（C）The line graph showed the ROSlevels over time.2.4.5 討論本章首先采用 HPLC 技術(shù)檢測(cè)鑒定了來(lái)源于山西的 BSCA 的組分，分別為矢車菊素 3-O-葡萄糖苷（C3G）、飛燕草素葡萄糖苷（D3G）、矮牽牛素葡萄糖苷（Pt3G）和矢車菊素（Cy）四種成分組成，其中主要成分為 C3G，含量為 10.02 mg/g。劉占
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2858184