在我國肝癌是一種高致死率的惡性疾病,它的預(yù)防與治療一直是解決的重點與難點。從自然界中尋找出一種天然無毒副作用的抗腫瘤藥物成了關(guān)注的熱點。本課題組前期研究了從黑豆皮中提取、分離與純化花青素成分的不同方法與最佳條件。但黑豆皮中花青素(Black soybean coats anthocyanins,BSCA)所含成分類型,及相關(guān)性質(zhì)與作用機制還需深入探討。為了進一步探究黑豆皮中花青素(BSCA)的抗氧化性能與其抑制肝癌的分子機制,本文主要通過以下內(nèi)容展開:1.通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對BSCA進行檢測分析,并與多種標品出峰時間比較得出所提BSCA的主要成分有四種,分別是飛燕草素葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素葡萄糖苷和矢車菊素。將不同濃度的BSCA作用于細胞,檢測細胞內(nèi)抗氧化酶指標、MDA指標以及ROS變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSCA促使SOD、CAT、GSH-Px等指標升高,而降低了MDA及ROS的水平,表明BSCA具有良好抗氧化性能。2.采用MTT和EDU法進行細胞增殖實驗檢測,篩選經(jīng)BSCA處理后抑制效果最明顯的細胞株,結(jié)果顯示BSCA抑制肝癌Hep G2細胞的效果最為顯著,且呈相應(yīng)的時間-劑量相關(guān)性。用不同濃度的BSCA分別作用于細胞,觀察細胞形態(tài)與細胞核的變化情況。結(jié)果表明,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)BSCA作用后,細胞形態(tài)發(fā)生了明顯皺縮,間隙增大,數(shù)量減少;細胞核發(fā)生皺縮,成月牙狀。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)BSCA作用細胞后,引起了線粒體膜電位的降低。3.用不同濃度的BSCA處理Hep G2細胞與SMMC7721細胞后,使用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR對JAK2/STAT3信號通路中的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3的蛋白水平以及基因水平的表達情況加以檢測,同時使用Western Blot方法檢測了凋亡途徑中相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53、p63等的表達情況。結(jié)果表明p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Caspase-3的表達量均隨作用濃度及時間的增加而降低,p53、p63的表達量逐漸升高。由此得出,BSCA能促進凋亡相關(guān)蛋白的表達而抗凋亡相關(guān)蛋白的表達受到了一定程度的抑制。另外,對JAK2采取shRNA干擾后,JAK2蛋白的表達明顯下調(diào),再將BSCA作用于shJAK2細胞株后,結(jié)果顯示出BSCA對shJAK2細胞中JAK2表達的抑制效果更為明顯。由此得出BSCA可通過抑制JAK2/STAT3信號通路致使肝癌Hep G2、SMMC7721細胞發(fā)生凋亡。上述結(jié)果為研發(fā)天然無毒副作用的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù),也為抗癌的靶向治療研究提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖 1.1 JAK2/STAT3 信號通路途徑Fig 1.1 JAK2/STAT3 signaling pathway1.2.2 JAK2/STAT3 信號通路與細胞凋亡JAK2（蛋白酪氨酸激酶 2）/STAT3（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子）信號途種人類癌細胞的生存、增殖與代謝方面顯露出特別關(guān)鍵的效能[26-28]。JAK2 是子受體信號傳輸?shù)闹匾盘栆蜃覽29]，若其收到刺激而活化后，JAK2 激酶就STAT3，STAT3 級聯(lián)的下游目標也被激活，發(fā)揮各自特有的功效，受 STAT3之基因皆和促癌生長、擴散、轉(zhuǎn)移等高度相關(guān)，如 BcL-2、Cyclin D1、c-Myc等，超常活性的 STAT3 可引發(fā)這些下游的目標基因過度表達，促使癌細胞的展[30-32]。STAT3 又為磷酸化的 JAK2 首選之下游靶基因，并在多種腫瘤細胞中活，保持活躍態(tài)，擁有原癌基因潛能，即致癌作用，以及抗凋亡活性[33,34]。于斷 STAT3 上游之激活因子 JAK2 或制止 STAT3 本身發(fā)生磷酸化成為了一種潛效抗癌策略。據(jù)了解，已研發(fā)多種 JAK2 的抑制劑，其中 AG490 是首個 JA制劑。通過抑制 JAK2 的活性和誘導(dǎo)凋亡，選擇性地抑制癌細胞的體內(nèi)外生

黑豆皮花青素對肝癌細胞的作用及分子機理研究.4 結(jié)果與分析.4.1 BSCA 成分分析與鑒定前期已通過探究得知最佳提取方法及相關(guān)提取優(yōu)化條件。本研究將用 D101脂純化后的 BSCA 進行 HPLC 分析其所含成分及含量，并與標準品參照比對出黑豆皮中花青素所含成分分別是（1）飛燕草素葡萄糖苷（D3G）占 6.7%、車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）占 64%、（3）矮牽牛素葡萄糖苷（Pt3G）占 34）矢車菊素（Cy）占 20.5%。結(jié)果如 Fig. 2.1 所示。其中所含主要的花青素 C3G，含量為 10.02 mg/g。

14圖 2.3 黑豆皮花青素對細胞內(nèi)活性氧的影響Fig. 2.3 Effects of anthocyanins from black soybean coats on ROS in Hep G2 cells andSMMC7721 cells. （A、B）The level of ROS was detected and analyzed by Flow cytometry inhepatoma cells.Cells were treated with 150 μg/mL BSCA for indicated times ,upon each experimentalgroup stained with DCFH-DA, and analyzed by Flow cytometry.（C）The line graph showed the ROSlevels over time.2.4.5 討論本章首先采用 HPLC 技術(shù)檢測鑒定了來源于山西的 BSCA 的組分，分別為矢車菊素 3-O-葡萄糖苷（C3G）、飛燕草素葡萄糖苷（D3G）、矮牽牛素葡萄糖苷（Pt3G）和矢車菊素（Cy）四種成分組成，其中主要成分為 C3G，含量為 10.02 mg/g。劉占
【參考文獻】

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本文編號：2858184