研究背景腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC),是指具有干細胞(stem cell)性質(zhì)的腫瘤細胞,又稱腫瘤起始細胞(tumor initiating cell，TIC),是一群處于靜息或休眠狀態(tài)、具有自我更新(self-renewal)和多向分化(multi-differentiation)能力的腫瘤細胞,被認為是腫瘤起始的重要因素,也是腫瘤復(fù)發(fā)過程中重建腫瘤的“種子細胞”。具有腫瘤干性(stemness)的腫瘤細胞即是腫瘤干細胞。腫瘤干性的增加是導(dǎo)致耐藥的重要因素。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是源于胚胎中胚層細胞的一種非造血成體干細胞,是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分。已知MSC在誘導(dǎo)化療耐藥中起著重要作用,其中重要的機制是MSC通過增加腫瘤細胞的干性從而誘導(dǎo)化療耐藥。然而,MSC促進腫瘤干性的機制尚不清楚。脂肪酸是除了葡萄糖和谷氨酰胺外腫瘤細胞最重要的能量代謝底物。研究發(fā)現(xiàn),脂肪酸氧化(fatty-acid oxidation，F(xiàn)AO)是腫瘤細胞獲得能量的重要來源之一。已有研究證實,脂肪酸氧化可促進腫瘤細胞的干性;MSC可通過促進腫瘤細胞脂肪酸的分泌從而誘導(dǎo)化療耐藥。由此,我們猜想,MSC可能通過脂肪酸氧化促進腫瘤細胞的干性和化療抵抗。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)MACC1-AS 1 是通過基因測序新發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)移基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)的反義LncRNA。我們的前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,胃癌細胞中的MACC1-AS1表達升高;MACC1-AS1可促進胃癌細胞脂肪酸氧化。據(jù)此,我們猜測,MACC1-AS1是否在MSC通過脂肪酸氧化促進胃癌細胞干性和化療抵抗中發(fā)揮重要作用。研究假設(shè)1.MSC可能促進胃癌細胞的干性和化療抵抗;2.脂肪酸氧化可能參與了 MSC促進胃癌細胞干性和化療抵抗的過程;3.MACC1-AS 1可能是介導(dǎo)MSC通過脂肪酸氧化促進胃癌細胞干性和化療抵抗的重要分子。研究內(nèi)容1.MSC對胃癌細胞干性和化療抵抗的影響細胞水平,MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,從RNA和蛋白水平驗證胃癌細胞干性的相關(guān)標(biāo)記分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28表達的改變；流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞干性標(biāo)記分子CD44陽性細胞的比例;成球?qū)嶒烌炞C胃癌細胞成球能力的改變;用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奧沙利鉑(oxaliplatin，OX)的條件培養(yǎng)基刺激胃癌細胞,觀察胃癌細胞與MSC共培養(yǎng)后,克隆形成能力的改變。動物水平,通過有限稀釋法(limiting dilution assay，LDA)構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型,將MSC與人源胃癌細胞以不同的比例接種于裸鼠皮下,通過檢測其成瘤能力,明確MSC對胃癌起始能力的影響。2.脂肪酸氧化對在MSC誘導(dǎo)的干性和化療抵抗過程中發(fā)揮的作用在明確MSC促進胃癌細胞干性的基礎(chǔ)上,我們進一步研究脂肪酸氧化在這個過程中發(fā)揮的作用。MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,從RNA和蛋白水平檢測脂肪酸氧化相關(guān)蛋白乙酰輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase,ACS)和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)的表達改變;試劑盒檢測胃癌細胞脂肪酸β氧化速率和ATP產(chǎn)生速率的改變;沉默脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶CPT1后,觀察干性相關(guān)分子RNA和蛋白水平的改變、MTT實驗檢測不同濃度5-FU和OX對其藥物敏感性的改變;回復(fù)實驗驗證脂肪酸氧化抑制劑乙莫克舍(etomoxir，ETX)逆轉(zhuǎn)MSC對胃癌細胞干性和化療抵抗的促進作用。3.MACC1-AS1在MSC促進胃癌細胞干性和化療抵抗中發(fā)揮的作用MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,檢測胃癌細胞MACC1-AS1表達的改變;提取老鼠皮下瘤RNA，對比MSC與胃癌細胞共同注射組和單純胃癌細胞注射組MACC1-AS1表達。構(gòu)建穩(wěn)定過表達MACC1-AS1的胃癌細胞株,與對照組相比,從PCR和蛋白水平驗證胃癌細胞干性的相關(guān)標(biāo)記分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28、CD44表達的改變;成球?qū)嶒烌炞C胃癌細胞成球能力的改變;用不同濃度5-FU和OX的條件培養(yǎng)基刺激胃癌細胞,MTT實驗觀察胃癌細胞藥物敏感性的改變。4.脂肪酸氧化對在MACC1-AS1促進干性和化療抵抗過程中發(fā)揮的作用過表達MACC1-AS1后,觀察胃癌細胞脂肪酸β氧化相關(guān)酶ACS和CPT1的RNA和蛋白水平改變；試劑盒檢測胃癌細胞脂肪酸β氧化速率和ATP產(chǎn)生速率的改變;回復(fù)實驗,分別用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR)及蛋白免疫印跡(western blotting)、成球?qū)嶒�、MTT驗證加入脂肪酸代謝抑制劑ETX是否能逆轉(zhuǎn)過表達MACC1-AS1對胃癌細胞干性相關(guān)分子、成球能力和化療抵抗的促進作用。5.MACC1-AS1通過脂肪酸氧化促進干性和化療抵抗的機制為了進一步挖掘MACC1-AS1通過脂肪酸氧化促進干性和化療抵抗的機制,通過LncRNASNP數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn):MACC1-AS1具有miR-145-5p的結(jié)合靶點。為了驗證兩者之間的關(guān)系,在RNA水平檢測過表達MACC1-AS1對miR-14-5p表達影響,接著,過表達miR-145-5p觀察胃癌細胞干性和藥物敏感性的改變;進一步利用回復(fù)實驗,驗證過表達miR-145-5p是否可逆轉(zhuǎn)MACC1-AS1對干性相關(guān)分子的表達、成球能力、化療藥物敏感性的促進作用。6.體內(nèi)抑制脂肪酸氧化對MSC誘導(dǎo)的化療化療抵抗的影響用胃癌細胞MKN45構(gòu)建皮下瘤小鼠模型,分為4組:GC組、GC+FOLFOX組、GC+FOLFOX+MSC組、GC+FOLFOX+MSC+ETX組,觀察抑制脂肪酸氧化后,是否可以降低MSC誘導(dǎo)的FOLFOX方案的抵抗作用;同時,對瘤體的進行石蠟包埋、切片、免疫組化染色,觀察干性相關(guān)標(biāo)記分子OCT4、脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT1、增殖、凋亡的指標(biāo)變化。研究結(jié)果1.MSC促進胃癌細胞干性和化療抵抗把MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,胃癌細胞干性的相關(guān)標(biāo)記分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28、CD44的RNA和蛋白水平表達升高、成球能力增加、對5-FU和OX的藥物敏感性降低。動物水平,將MSC與人源胃癌細胞以不同的比例接種于裸鼠皮下,發(fā)現(xiàn)MSC可以增加小鼠的成瘤能力。2.MSC通過脂肪酸氧化促進胃癌細胞干性和化療抵抗把MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,胃癌細胞中脂肪酸氧化的相關(guān)酶的表達升高,脂肪酸β氧化速率和ATP產(chǎn)生速率增加;利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)干擾CPT1的表達后,胃癌細胞干性相關(guān)分子的表達降低,對5-FU和OX的藥物敏感性升高。進一步地加入CPT1的抑制劑ETX后,可以逆轉(zhuǎn)MSC對于胃癌細胞的干性和化療抵抗作用。3.MACC1-AS1介導(dǎo)MSC促進胃癌細胞干性和化療抵抗為了進一步檢測MSC通過脂肪酸氧化促進胃癌細胞干性和化療抵抗的機制,MSC與胃癌細胞共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)胃癌細胞MACC1-AS1表達升高;提取老鼠皮下瘤的RNA，與單純注射胃癌細胞組相比,共同注射MSC與胃癌細胞組的MACC1-AS1表達升高。過表達MACC1-AS1可促進胃癌細胞干性的相關(guān)標(biāo)記分子RNA和蛋白水平表達升高、成球能力增加、對5-FU和OX的藥物敏感性降低。4.MACC1-AS1通過脂肪酸氧化促進干性和化療抵抗過表達MACC1-AS1后,胃癌細胞中ACS和CPT1的表達升高,脂肪酸β氧化速率和ATP產(chǎn)生速率增加；加入脂肪酸氧化抑制劑ETX后,可以逆轉(zhuǎn)MACC1-AS1對干性相關(guān)分子的表達、成球能力促進作用,使MACC1-AS1對5-FU和OX敏感性得到回復(fù)。5.MACC1-AS1通過miR-145-5p調(diào)控脂肪酸氧化,從而促進干性和化療抵抗過表達miR-145-5p后,干性相關(guān)分子和脂肪酸氧化相關(guān)酶的表達降低、胃癌細胞對5-FU和OX的敏感性增加,ATP產(chǎn)生速率降低,提示miR-145-5p可以抑制胃癌干性和化療抵抗。過表達MACC1-AS1后可抑制miR-145-5p表達,。過表達miR-145-5p可以逆轉(zhuǎn)MACC1-AS1對脂肪酸氧化、干性和化療抵抗的促進作用。6.體內(nèi)抑制脂肪酸氧化對MSC誘導(dǎo)的化療抵抗的影響腹腔注射脂肪酸氧化抑制劑ETX后,逆轉(zhuǎn)了 MSC導(dǎo)致的FOLFOX方案的敏感性的降低,瘤體切片免疫組化染色中,干性相關(guān)標(biāo)記分子OCT4、脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT1、增殖的標(biāo)記分子ki-67也顯著地降低,凋亡的指標(biāo)cleaved caspased 3變化。小鼠心、肝、脾、肺、腎的HE染色提示ETX對小鼠的重要臟器結(jié)構(gòu)尚未發(fā)現(xiàn)有影響。研究結(jié)論MSC通過上調(diào)胃癌細胞MACC1-AS1表達,增強脂肪酸氧化,從而促進胃癌細胞干性和化療抵抗。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 MSC對胃癌細胞干性和化療抵抗的影響
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
第二章 脂肪酸氧化對在MSC誘導(dǎo)的干性和化療抵抗過程中發(fā)揮的作用
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
第三章 MACC1-AS1在MSC促進胃癌細胞干性和化療抵抗中發(fā)揮的作用
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
第四章 脂肪酸氧化對在MACC1-AS1促進干性和化療抵抗過程中發(fā)揮的作用
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
第五章 MACC1-AS1通過脂肪酸氧化促進干性和化療抵抗的機制
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
第六章 體內(nèi)抑制脂肪酸氧化降低MSC誘導(dǎo)的化療抵抗的影響
    一、前言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論
    五、結(jié)論
總結(jié)
參考文獻
中英文縮略詞對照表
攻讀碩士學(xué)位期間的成果
致謝

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本文編號：2857868