目的:探討microRNA-378(miR-378)對腎癌細胞體外增殖和遷移能力的影響及其可能的作用機制并探討miR-378對前列腺癌細胞體外增殖能力及對成骨前體細胞分化的影響。方法:在腎癌的相關研究中(第一部分),使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析腎癌和正常腎上皮組織中miR-378的表達情況并使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法在人腎癌細胞系及人腎小管上皮細胞系(HK2)中驗證miR-378的表達情況。人工合成miR-378 mimic和inhibitor并轉(zhuǎn)染腎癌細胞系。使用CCK8法檢測miR-378對腎癌細胞增殖的影響,通過Transwell實驗和劃痕愈合實驗檢測miR-378對腎癌細胞遷移的影響,通過生物信息學分析篩選腎癌細胞中miR-378可能的靶基因并通過qRT-PCR及蛋白免疫印跡(western blot)方法驗證。在前列腺癌的相關研究中(第二部分),通過掃描電鏡觀察及粒徑分布儀檢測分析不同來源外泌體的形態(tài)和純度。人工合成miR-378 mimic并分別轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系LNCaP細胞和小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1細胞。通過qRT-PCR檢測比較前列腺癌細胞系LNCaP細胞和前列腺良性增生細胞系BPH1細胞培養(yǎng)上清來源的外泌體中miR-378的表達差異。使用CCK8法檢測miR-378并同時抑制外泌體的釋放對LNCaP細胞增殖的影響。通過生物信息學分析并通過qRT-PCR、免疫熒光染色驗證LNCaP細胞及MC3T3-E1細胞中過表達miR-378并抑制外泌體釋放后miR-378相應靶基因的表達變化。結果:在腎癌的相關研究中(第一部分)我們發(fā)現(xiàn)miR-378在腎癌組織和腎癌細胞系中表達顯著上調(diào)(P0.001);過表達miR-378在體外促進腎癌細胞的增殖(P0.01)及遷移能力(P0.001)。本研究首次在腎癌中篩選并鑒定了miR-378的靶基因大型腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2,LATS2),qRT-PCR和western blot實驗進一步驗證了該基因表達與miR-378的表達呈負相關。在前列腺癌的相關研究中(第二部分),qRT-PCR實驗表明,與BPH1細胞比較,LNCaP細胞體外培養(yǎng)上清來源的外泌體中miR-378表達量顯著升高(P0.01)。在LNCaP細胞中過表達miR-378并同時抑制外泌體釋放在體外可抑制前列腺癌細胞的增殖(P0.01)。在MC3T3-E1細胞中過表達miR-378并抑制外泌體釋放顯著上調(diào)成骨前體細胞分化標志物osteocalcin、OSX的表達。本研究首次在前列腺癌細胞中篩選并鑒定了miR-378的靶基因MAOA,在MC3T3-E1細胞中篩選并鑒定了miR-378的靶基因Gli3和Schnurri3,通過qRT-PCR驗證了靶基因的表達與miR-378的表達呈負相關。在LNCaP和MC3T3-E1細胞中分別過表達miR-378并抑制外泌體釋放可抑制MAOA及Gli3和Schnurri3的表達(P0.01)。結論:腎癌的相關研究中(第一部分)表明,在體外過表達miR-378可通過抑制LATS2表達增強人腎癌細胞的增殖和遷移。前列腺癌的相關研究中(第二部分)表明,體外過表達miR-378可通過抑制MAOA表達而抑制前列腺癌細胞的增殖,可通過抑制Gli3和Schnurri3表達促進成骨前體細胞的分化。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737
【部分圖文】：

圖 1-1 miR-378 在腎癌臨床樣本和腎癌細胞系中的顯著高表達。 A:腎癌組織和正常腎上皮組織的 miR-378 的相對表達情況。NC：正常腎上皮組織對照。B：癌組織高表達和低表達 miR-378 的腎癌病人的總體生存情況。C：qRT-PCR 檢測腎癌細胞系和腎小管上皮細胞系中 miR-378 的相對表達情況。Figure 1-1 miR-378 is significantly overexpressed in renal Carcinoma tissues and cell lines.A: The relative expression level of miR-378 in renal Carcinoma tissues（n=379） and normal renaltissues(n=36). NC: normal control *P<0.05. B: Kaplan-Meier analysis of the overall survival ofpatients with renal carcinoma with high and low levels of miR-378 expression. *** P<0.001. C: Therelative expression level of miR-378 in renal Carcinoma cell lines and in renal proximal tubularepithelial cell line (HK2) detected by qRT-PCR. *** P<0.001.3.2 過表達或者敲低 miR-378 對腎癌細胞增殖的影響為了研究 miR-378 對細胞增殖的影響，我們首先將 miR-378mimic 轉(zhuǎn)染 786-O和 Caki-1 細胞，利用 CCK-8 方法分析細胞增殖能力的變化。如圖 2A 顯示，過表

圖 1-2: miR-378 可顯著促進 786-O 和 Caki-1 細胞的增殖。 A：CCK8 實驗表明 miR-378表達可明顯促進786-O和Caki-1 細胞的增殖。B: 敲降miR-378則明顯抑制786-O和Caki-1胞的增殖Figure 1-2: miR-378 promoted the proliferation of 786-O and Caki-1 cells. A：miR-378verexpression significantly promoted the growth of both 786-O and Caki-1 cells. B: miR-378nockdown significantly inhibited the growth of both 786-O and Caki-1 cells, as demonstrated byCK-8 proliferation assay..3 過表達或者敲低 miR-378 對腎癌細胞遷移的影響我們選取低表達 miR-378 的腎癌細胞系 786-O 過表達 miR-378,選擇高表達iR-378 的腎癌細胞系 Caki-1 進行敲降 miR-378，利用 Transwell 小室檢測 miR-378腎癌細胞遷移能力的影響。結果顯示，過表達 miR-378 后 786-O 細胞的遷移能顯著增加（P＜0.001）（圖 3A）。敲降 miR-378 后 Caki-1 細胞的遷移能力顯著減

圖 1-3：miR-378 對腎癌細胞遷移的影響。 A：過表達 miR-378 可以顯著增加 786-O 細胞的遷移能力。B：敲降 miR-378 可以顯著降低 Caki-1 細胞的遷移能力。Figure1-3: The effect of miR-378 on the migration of renal cancer cells. A: miR-378overexpression significantly promoted the migration of 786-O cells. B: miR-378 knockdownsignificantly inhibited the migration of Caki-1 cells. Migrated cells were counted under a 100×microscope field. Scale Bar: ***P<0.001.3.4 過表達或者敲低 miR-378 對腎癌細胞遷移的影響分別在 786-O 細胞中過表達 miR-378、在 Caki-1 細胞中敲降 miR-378 后，利用劃痕愈合實驗檢測 miR-378 對腎癌細胞遷移的影響。如圖 4A 顯示，過表達miR-378 促進 786-O 細胞的遷移。敲降 miR-378 抑制 Caki-1 細胞的遷移。
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本文編號：2857380