目的1、觀察人蛋白酶體β亞基4型(PSMB4)在肝細胞肝癌(簡稱肝癌,HCC)患者組織中的表達情況,探討PSMB4在肝癌患者癌組織中的表達水平與各臨床參數(shù)之間的關系及其作為肝癌預后標記物和治療靶點的意義。2、利用特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)技術構建干擾PSMB4表達的肝癌細胞,并進一步闡明PSMB4對肝癌細胞增殖、凋亡能力的影響。方法1、組織水平,通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析PSMB4在肝癌組織中的表達情況,然后利用蛋白質免疫印跡檢測8例肝癌患者癌及癌旁組織樣本中PSMB4蛋白表達的差異;應用免疫組織化學法對105例肝癌患者的癌組織及25例正常肝組織進行檢測,以進一步分析PSMB4蛋白在肝癌中的表達情況,并結合臨床病理資料分析其表達情況與患者性別、年齡、血清AFP水平、肝硬化、腫瘤數(shù)量、HBV感染、最大腫瘤直徑、腫瘤轉移、微血管侵犯、腫瘤分化程度、TNM分期等因素之間的關系;應用Cox風險回歸模型進行單因素及多因素分析影響肝癌患者生存的危險因素,然后通過TCGA數(shù)據(jù)庫及Kaplan-Meier法分析PSMB4的表達水平與肝癌患者生存之間的關系。2、細胞水平,利用蛋白質免疫印跡檢測正常肝細胞系(L02)和三種肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、LM3)中PSMB4的基礎表達情況。然后設計PSMB4基因特異性shRNA質粒并轉染入SMMC7721細胞,轉染成功后檢測PSMB4干擾效率,并運用平板克隆實驗、MTT實驗及流式細胞儀檢測轉染組和對照組細胞的增殖及凋亡情況。結果1、TCGA數(shù)據(jù)庫顯示PSMB4基因在肝癌mRNA水平的表達顯著高于正常肝組織(P0.05)。蛋白質免疫印跡結果顯示,7例肝癌患者的癌組織中PSMB4蛋白表達水平顯著高于對應的癌旁組織(P0.05),另外1例患者的表達差異不明顯。免疫組化染色結果顯示在105例肝癌組織中PSMB4高表達57例(54.3%),低表達48例(45.7%),而在25例正常肝組織中多為低表達或不表達(68%)。肝癌組織中PSMB4高表達與HBV感染、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度、TNM分期有關(P0.05)。單因素和多因素分析表明肝癌患者5年生存情況與腫瘤大小、腫瘤轉移、分化程度、TNM分期、PSMB4表達水平有關,其中腫瘤轉移和PSMB4高表達是肝癌患者的獨立危險因素(P0.05)。TCGA數(shù)據(jù)庫與Kaplan-Meier生存曲線分析均表明PSMB4高表達的患者比PSMB4低表達患者生存時間短(P0.05)。2、PSMB4在肝癌HepG2細胞和SMMC7721細胞中表達顯著高于正常肝L02細胞。另外,本研究成功構建干擾PSMB4表達的SMMC7721實驗組細胞,干擾效率明顯。平板克隆實驗、MTT實驗和流式細胞儀檢測結果表明干擾PSMB4表達后的SMMC7721細胞增殖能力減弱,凋亡能力增強(P0.05)。結論1、PSMB4在肝癌組織中的表達高于癌旁肝組織,其表達水平與HBV感染、腫瘤大小、組織學分級及TNM分期有關。2、PSMB4高表達是肝癌患者獨立的差的預后因素,因此PSMB4可作為肝癌預后的潛在標志及治療的潛在靶點。3、干擾PSMB4表達可以抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡。
【學位單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

南通大學碩士學位論文 第三章 結 果第三章 結 果3.1 肝癌組織及癌旁肝組織中 PSMB4 的表達情況首先，我們利用 TCGA 數(shù)據(jù)庫對 PSMB4 在肝癌 mRNA 水平的表達進行了分析，結果顯示 PSMB4 在肝癌組織的表達顯著高于正常肝組織（P<0.05, 圖 1）。隨后，我們對隨機選取的 8 例肝癌患者新鮮組織樣本，運用 western blot 檢測對應的癌及癌旁組織中 PSMB4 蛋白的表達情況，GAPDH 為內參得到標化的PSMB4 蛋白表達量。結果顯示，在 7 例樣本中肝癌組織的 PSMB4 蛋白表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05），另 1 例樣本表達無差異（P>0.05），如圖 2 所示。

圖 2 肝癌組織中 PSMB4 蛋白的表達情況A. Westernblot 檢測 PSMB4 在 8 例隨機選取的配對樣本中的蛋白表達水平（T，tumor，肝癌組織；N，normal，癌旁肝組織）；B. PSMB4/GAPDH 灰度分析結果（*P<0.05）。3.2 肝癌組織樣本中 PSMB4 的免疫組化染色結果為了進一步研究 PSMB4 在肝癌組織中的表達，我們對納入研究的 105 例肝癌患者的癌組織及 25 例正常肝組織進行石蠟包埋，制作病理組織切片，然后進行 PSMB4 免疫組織化學染色分析。觀察 PSMB4 在肝癌組織及正常肝組織切片上的染色情況，結果發(fā)現(xiàn) PSMB4 染色主要分布于細胞漿和細胞核內，染色呈棕色及棕黃色顆粒樣（圖 3）。在納入研究的 105 例肝癌組織中，57 例（54.29%）顯示為 PSMB4 高表達，余下的 48 例（45.71%）顯示為 PSMB4 低表達，而在25 例正常肝組織中 8 例（32%）顯示為 PSMB4 高表達，17 例（68%）顯示為PSMB4 低表達或者不表達，表達差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=4.0114, P<0.05）（表5）。

17圖 3 肝癌及癌旁組織的 PSMB4 免疫組化染色結果A. 低分化肝癌組織強陽性染色 (+++)；B. 中分化肝癌組織中陽性染色的 (++)； C. 高分化肝癌組織弱陽性染色的 (+)；D. 正常肝組織陰性表達 (－)（×200）。3.3 肝癌組織中 PSMB4 的表達水平與各種臨床病理參數(shù)的關系為了進一步明確 PSMB4 的表達在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過 χ2 檢驗分析了 PSMB4 的表達水平和肝癌患者臨床病理因素之間的相關性。根據(jù)PSMB4 的表達情況，將肝癌標本分為兩個組，PSMB4 高表達組（總評分大于 3分）和 PSMB4 低表達組（總評分小于等于 3 分）。結果顯示，PSMB4 的表達水平與 HBV 感染、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度、TNM 分期有關（P<0.05）；而與其他臨床病理的因素，如年齡、性別、血清 AFP 水平、肝硬化、腫瘤數(shù)目、腫瘤轉移和微血管侵犯沒有相關性（P>0.05，表 6）。
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本文編號：2857068