目的1、觀察人蛋白酶體β亞基4型(PSMB4)在肝細(xì)胞肝癌(簡稱肝癌,HCC)患者組織中的表達(dá)情況,探討PSMB4在肝癌患者癌組織中的表達(dá)水平與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系及其作為肝癌預(yù)后標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的意義。2、利用特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)技術(shù)構(gòu)建干擾PSMB4表達(dá)的肝癌細(xì)胞,并進(jìn)一步闡明PSMB4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響。方法1、組織水平,通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析PSMB4在肝癌組織中的表達(dá)情況,然后利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測8例肝癌患者癌及癌旁組織樣本中PSMB4蛋白表達(dá)的差異;應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)105例肝癌患者的癌組織及25例正常肝組織進(jìn)行檢測,以進(jìn)一步分析PSMB4蛋白在肝癌中的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床病理資料分析其表達(dá)情況與患者性別、年齡、血清AFP水平、肝硬化、腫瘤數(shù)量、HBV感染、最大腫瘤直徑、腫瘤轉(zhuǎn)移、微血管侵犯、腫瘤分化程度、TNM分期等因素之間的關(guān)系;應(yīng)用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析影響肝癌患者生存的危險(xiǎn)因素,然后通過TCGA數(shù)據(jù)庫及Kaplan-Meier法分析PSMB4的表達(dá)水平與肝癌患者生存之間的關(guān)系。2、細(xì)胞水平,利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測正常肝細(xì)胞系(L02)和三種肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC7721、LM3)中PSMB4的基礎(chǔ)表達(dá)情況。然后設(shè)計(jì)PSMB4基因特異性shRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入SMMC7721細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后檢測PSMB4干擾效率,并運(yùn)用平板克隆實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果1、TCGA數(shù)據(jù)庫顯示PSMB4基因在肝癌mRNA水平的表達(dá)顯著高于正常肝組織(P0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,7例肝癌患者的癌組織中PSMB4蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P0.05),另外1例患者的表達(dá)差異不明顯。免疫組化染色結(jié)果顯示在105例肝癌組織中PSMB4高表達(dá)57例(54.3%),低表達(dá)48例(45.7%),而在25例正常肝組織中多為低表達(dá)或不表達(dá)(68%)。肝癌組織中PSMB4高表達(dá)與HBV感染、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度、TNM分期有關(guān)(P0.05)。單因素和多因素分析表明肝癌患者5年生存情況與腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、PSMB4表達(dá)水平有關(guān),其中腫瘤轉(zhuǎn)移和PSMB4高表達(dá)是肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)。TCGA數(shù)據(jù)庫與Kaplan-Meier生存曲線分析均表明PSMB4高表達(dá)的患者比PSMB4低表達(dá)患者生存時(shí)間短(P0.05)。2、PSMB4在肝癌HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中表達(dá)顯著高于正常肝L02細(xì)胞。另外,本研究成功構(gòu)建干擾PSMB4表達(dá)的SMMC7721實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,干擾效率明顯。平板克隆實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明干擾PSMB4表達(dá)后的SMMC7721細(xì)胞增殖能力減弱,凋亡能力增強(qiáng)(P0.05)。結(jié)論1、PSMB4在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁肝組織,其表達(dá)水平與HBV感染、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)及TNM分期有關(guān)。2、PSMB4高表達(dá)是肝癌患者獨(dú)立的差的預(yù)后因素,因此PSMB4可作為肝癌預(yù)后的潛在標(biāo)志及治療的潛在靶點(diǎn)。3、干擾PSMB4表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。
【學(xué)位單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

南通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第三章 結(jié) 果第三章 結(jié) 果3.1 肝癌組織及癌旁肝組織中 PSMB4 的表達(dá)情況首先，我們利用 TCGA 數(shù)據(jù)庫對(duì) PSMB4 在肝癌 mRNA 水平的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示 PSMB4 在肝癌組織的表達(dá)顯著高于正常肝組織（P<0.05, 圖 1）。隨后，我們對(duì)隨機(jī)選取的 8 例肝癌患者新鮮組織樣本，運(yùn)用 western blot 檢測對(duì)應(yīng)的癌及癌旁組織中 PSMB4 蛋白的表達(dá)情況，GAPDH 為內(nèi)參得到標(biāo)化的PSMB4 蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，在 7 例樣本中肝癌組織的 PSMB4 蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P<0.05），另 1 例樣本表達(dá)無差異（P>0.05），如圖 2 所示。

圖 2 肝癌組織中 PSMB4 蛋白的表達(dá)情況A. Westernblot 檢測 PSMB4 在 8 例隨機(jī)選取的配對(duì)樣本中的蛋白表達(dá)水平（T，tumor，肝癌組織；N，normal，癌旁肝組織）；B. PSMB4/GAPDH 灰度分析結(jié)果（*P<0.05）。3.2 肝癌組織樣本中 PSMB4 的免疫組化染色結(jié)果為了進(jìn)一步研究 PSMB4 在肝癌組織中的表達(dá)，我們對(duì)納入研究的 105 例肝癌患者的癌組織及 25 例正常肝組織進(jìn)行石蠟包埋，制作病理組織切片，然后進(jìn)行 PSMB4 免疫組織化學(xué)染色分析。觀察 PSMB4 在肝癌組織及正常肝組織切片上的染色情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PSMB4 染色主要分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，染色呈棕色及棕黃色顆粒樣（圖 3）。在納入研究的 105 例肝癌組織中，57 例（54.29%）顯示為 PSMB4 高表達(dá)，余下的 48 例（45.71%）顯示為 PSMB4 低表達(dá)，而在25 例正常肝組織中 8 例（32%）顯示為 PSMB4 高表達(dá)，17 例（68%）顯示為PSMB4 低表達(dá)或者不表達(dá)，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.0114, P<0.05）（表5）。

17圖 3 肝癌及癌旁組織的 PSMB4 免疫組化染色結(jié)果A. 低分化肝癌組織強(qiáng)陽性染色 (+++)；B. 中分化肝癌組織中陽性染色的 (++)； C. 高分化肝癌組織弱陽性染色的 (+)；D. 正常肝組織陰性表達(dá) (－)（×200）。3.3 肝癌組織中 PSMB4 的表達(dá)水平與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系為了進(jìn)一步明確 PSMB4 的表達(dá)在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過 χ2 檢驗(yàn)分析了 PSMB4 的表達(dá)水平和肝癌患者臨床病理因素之間的相關(guān)性。根據(jù)PSMB4 的表達(dá)情況，將肝癌標(biāo)本分為兩個(gè)組，PSMB4 高表達(dá)組（總評(píng)分大于 3分）和 PSMB4 低表達(dá)組（總評(píng)分小于等于 3 分）。結(jié)果顯示，PSMB4 的表達(dá)水平與 HBV 感染、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度、TNM 分期有關(guān)（P<0.05）；而與其他臨床病理的因素，如年齡、性別、血清 AFP 水平、肝硬化、腫瘤數(shù)目、腫瘤轉(zhuǎn)移和微血管侵犯沒有相關(guān)性（P>0.05，表 6）。
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