目的 以PD-1/PD-L1抗體為代表的腫瘤免疫治療有效提高了黑色素瘤、非小細胞肺癌和肝癌等多種腫瘤患者的預后。研究表明PD-1/PD-L1抗體的有效性與腫瘤細胞表面PD-L1的表達密切相關。本研究的目的是構建PD-L1的重組真核表達載體,研究RNF125與PD-L1相互作用及這種相互作用對PD-L1的表達的影響,并進一步研究RNF125調控PD-L1的分子機制。方法 1、通過重組PCR方法,將PD-L1的cDNA插入到pCMV-Myc-Vector和pCMV-HA-Vector中,構建pCMV-Myc-PD-L1和pCMV-HA-PD-L1重組真核表達載體。2、通過免疫印跡及免疫共沉淀方法,研究RNF125與PD-L1的相互作用及這種相互作用對PD-L1蛋白表達量的影響。3、通過RT-PCR及免疫印跡方法,研究在IFN-γ刺激下RNF125對人肝癌HepG2細胞中PD-L1表達的調控作用。4、通過泛素化實驗,研究RNF125調控PD-L1發(fā)生泛素化的結構域及泛素化的形式。結果 1、將酶切后的目的基因與空載體連接起來,再經轉化、涂板、挑單克隆后進行RCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示在750bp~1000bp的位置可見目的條帶。選取插入目的基因的細菌克隆菌液進行測序,結果顯示陽性菌液的測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中人PD-L1基因序列完全一致。將重組質粒轉化到293T細胞中,通過免疫蛋白印跡在35Kd的位置可見到目的條帶,表明PD-L1的重組真核表達載體構建成功。2、將Flag-RNF125與Myc-PD-L1共轉染至293T細胞中,通過免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)Flag-RNF125可與Myc-PD-L1發(fā)生相互作用,將濃度依次增加的Myc-RNF125與HA-PD-L1共轉染至293T細胞中,通過免疫印跡實驗,發(fā)現(xiàn)Myc-RNF125可以下調HA-PD-L1的表達,并呈劑量依賴性,表明RNF125可與PD-L1相互作用并下調PD-L1的表達。3、通過過表達或RNAi技術,上調或下調人肝癌HepG2細胞中RNF125的表達,采用RT-PCR和免疫印實驗,與對照組相比,過表達RNF125可以促進HepG2細胞中IFN-γ引起的PD-L1的表達水平下調,而敲低RNF125可以促進HepG2細胞中IFN-γ引起的PD-L1的表達水平上調,表明RNF125可能通過調控PD-L1參與肝癌腫瘤免疫。4、將RNF125(WT或C72,75A)、Ub(WT,K48only或K63only)、PD-L1共轉染至293T細胞中,通過泛素化實驗發(fā)現(xiàn)RNF125可以使PD-L1發(fā)生K48位連接形式的泛素化修飾,而Ring結構域突變的RNF125則不影響PD-L1的泛素化水平,表明RNF125通過K48位形式的泛素化修飾PD-L1從而參與腫瘤免疫。結論 本研究成功構建了PD-L1的重組真核表達載體,并發(fā)現(xiàn)RNF125可以與PD-L1發(fā)生相互作用降低PD-L1蛋白的穩(wěn)定性;進一步研究發(fā)現(xiàn),RNF125能夠使PD-L1發(fā)生K48連接形式的泛素化,而RNF125泛素化酶活性缺失突變體則喪失了這樣的功能。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

可以通過調控免疫檢查點分子參與腫瘤免疫逃逸。用腫瘤微環(huán)境人為地增強或正常化機體的免疫功能、抑現(xiàn)階段臨床腫瘤免疫治療方案的主要機制。目前研究較方案包括溶瘤病毒疫苗、細胞過繼免疫治療（CAR-T，C查點阻斷劑（CTLA-4，PD-1/PD-L1抗體）等[6-8]。其中嵌疫療法(CAR-T)細胞在治療血液腫瘤的臨床試驗得實質4抗體作為第一個上市的免疫檢查點阻斷劑也有效的提高的預后，而PD-1和PD-L1抗體因在黑色素瘤、非小細胞肺胱癌和霍奇金淋巴瘤等15余種腫瘤的治療中均取得了實的受到關注[9]。目前抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體已成為腫熱點。

-L1 促進腫瘤免疫的分子機制研究 別信號，是 TCR（T 細胞受體）與抗原要組織相容性復合體）的特異性結合；C 表達的協(xié)同刺激分子（如 CD28/B7）和及 TIM-3 等）與 T 細胞表面的相應受體續(xù)時間。正常組織中，PD-L1 和 PD-1維持自身免疫耐受，防止自身免疫性用過表達的 PD-L1 分子抑制 T 細胞的

介導靶蛋白通過蛋白酶體途徑降解，而K63連接的泛素化修飾則通常參與信號轉導途徑，包括DNA損傷修復和蛋白激酶的激活等，為蛋白的相互作用提供分子平臺（圖3）。圖3：泛素化修飾示意圖RNF125，又稱為TRAC-1 (T cell RING protein identified in activationscreen)。人類的RNF125基因定位于18號染色體，其cDNA全長699bp，所編碼的蛋白具有232個氨基酸，在骨髓、脾臟、胸腺、淋巴組織中大量存在[20]。RNF125屬于RING結構域家族的泛素E3連接酶，包括五個結構域，即N端的RING結構域，C端的三個串聯(lián)的鋅指樣結構域（一個C2HC結構域，兩個C2H2結構域）以及一個泛素結合基序UIM (Ubiquitin interacting motif)[21](圖4)
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本文編號：2856903