目的 以PD-1/PD-L1抗體為代表的腫瘤免疫治療有效提高了黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和肝癌等多種腫瘤患者的預(yù)后。研究表明PD-1/PD-L1抗體的有效性與腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)密切相關(guān)。本研究的目的是構(gòu)建PD-L1的重組真核表達(dá)載體,研究RNF125與PD-L1相互作用及這種相互作用對(duì)PD-L1的表達(dá)的影響,并進(jìn)一步研究RNF125調(diào)控PD-L1的分子機(jī)制。方法 1、通過重組PCR方法,將PD-L1的cDNA插入到pCMV-Myc-Vector和pCMV-HA-Vector中,構(gòu)建pCMV-Myc-PD-L1和pCMV-HA-PD-L1重組真核表達(dá)載體。2、通過免疫印跡及免疫共沉淀方法,研究RNF125與PD-L1的相互作用及這種相互作用對(duì)PD-L1蛋白表達(dá)量的影響。3、通過RT-PCR及免疫印跡方法,研究在IFN-γ刺激下RNF125對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的調(diào)控作用。4、通過泛素化實(shí)驗(yàn),研究RNF125調(diào)控PD-L1發(fā)生泛素化的結(jié)構(gòu)域及泛素化的形式。結(jié)果 1、將酶切后的目的基因與空載體連接起來(lái),再經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆后進(jìn)行RCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示在750bp~1000bp的位置可見目的條帶。選取插入目的基因的細(xì)菌克隆菌液進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示陽(yáng)性菌液的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人PD-L1基因序列完全一致。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到293T細(xì)胞中,通過免疫蛋白印跡在35Kd的位置可見到目的條帶,表明PD-L1的重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。2、將Flag-RNF125與Myc-PD-L1共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,通過免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)Flag-RNF125可與Myc-PD-L1發(fā)生相互作用,將濃度依次增加的Myc-RNF125與HA-PD-L1共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,通過免疫印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Myc-RNF125可以下調(diào)HA-PD-L1的表達(dá),并呈劑量依賴性,表明RNF125可與PD-L1相互作用并下調(diào)PD-L1的表達(dá)。3、通過過表達(dá)或RNAi技術(shù),上調(diào)或下調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞中RNF125的表達(dá),采用RT-PCR和免疫印實(shí)驗(yàn),與對(duì)照組相比,過表達(dá)RNF125可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞中IFN-γ引起的PD-L1的表達(dá)水平下調(diào),而敲低RNF125可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞中IFN-γ引起的PD-L1的表達(dá)水平上調(diào),表明RNF125可能通過調(diào)控PD-L1參與肝癌腫瘤免疫。4、將RNF125(WT或C72,75A)、Ub(WT,K48only或K63only)、PD-L1共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,通過泛素化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNF125可以使PD-L1發(fā)生K48位連接形式的泛素化修飾,而Ring結(jié)構(gòu)域突變的RNF125則不影響PD-L1的泛素化水平,表明RNF125通過K48位形式的泛素化修飾PD-L1從而參與腫瘤免疫。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了PD-L1的重組真核表達(dá)載體,并發(fā)現(xiàn)RNF125可以與PD-L1發(fā)生相互作用降低PD-L1蛋白的穩(wěn)定性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RNF125能夠使PD-L1發(fā)生K48連接形式的泛素化,而RNF125泛素化酶活性缺失突變體則喪失了這樣的功能。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

可以通過調(diào)控免疫檢查點(diǎn)分子參與腫瘤免疫逃逸。用腫瘤微環(huán)境人為地增強(qiáng)或正�；瘷C(jī)體的免疫功能、抑現(xiàn)階段臨床腫瘤免疫治療方案的主要機(jī)制。目前研究較方案包括溶瘤病毒疫苗、細(xì)胞過繼免疫治療（CAR-T，C查點(diǎn)阻斷劑（CTLA-4，PD-1/PD-L1抗體）等[6-8]。其中嵌疫療法(CAR-T)細(xì)胞在治療血液腫瘤的臨床試驗(yàn)得實(shí)質(zhì)4抗體作為第一個(gè)上市的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑也有效的提高的預(yù)后，而PD-1和PD-L1抗體因在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺胱癌和霍奇金淋巴瘤等15余種腫瘤的治療中均取得了實(shí)的受到關(guān)注[9]。目前抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體已成為腫熱點(diǎn)。

-L1 促進(jìn)腫瘤免疫的分子機(jī)制研究 別信號(hào)，是 TCR（T 細(xì)胞受體）與抗原要組織相容性復(fù)合體）的特異性結(jié)合；C 表達(dá)的協(xié)同刺激分子（如 CD28/B7）和及 TIM-3 等）與 T 細(xì)胞表面的相應(yīng)受體續(xù)時(shí)間。正常組織中，PD-L1 和 PD-1維持自身免疫耐受，防止自身免疫性用過表達(dá)的 PD-L1 分子抑制 T 細(xì)胞的

介導(dǎo)靶蛋白通過蛋白酶體途徑降解，而K63連接的泛素化修飾則通常參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括DNA損傷修復(fù)和蛋白激酶的激活等，為蛋白的相互作用提供分子平臺(tái)（圖3）。圖3：泛素化修飾示意圖RNF125，又稱為TRAC-1 (T cell RING protein identified in activationscreen)。人類的RNF125基因定位于18號(hào)染色體，其cDNA全長(zhǎng)699bp，所編碼的蛋白具有232個(gè)氨基酸，在骨髓、脾臟、胸腺、淋巴組織中大量存在[20]。RNF125屬于RING結(jié)構(gòu)域家族的泛素E3連接酶，包括五個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端的RING結(jié)構(gòu)域，C端的三個(gè)串聯(lián)的鋅指樣結(jié)構(gòu)域（一個(gè)C2HC結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域）以及一個(gè)泛素結(jié)合基序UIM (Ubiquitin interacting motif)[21](圖4)
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本文編號(hào)：2856903