膠質(zhì)瘤是較為常見的原發(fā)性腦腫瘤,約占40%,5年生存率約為20-30%。其中,膠質(zhì)母細胞瘤惡性程度最高,約占膠質(zhì)瘤的50%,年發(fā)生率為3/100,000-4/100,000人口。膠質(zhì)母細胞瘤侵襲性強,復發(fā)率高,預后差,中位生存時間約14.6個月,3年生存率約為16%,5年生存率不到2%。近年來,雖然治療策略和技術獲得了不斷的進步,但是此類患者的生存期和生存率并沒有明顯的提高。深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展的分子機制、并探索關鍵的分子靶點,將有助于突破膠質(zhì)瘤治療的瓶頸,進一步改善患者的預后。腫瘤細胞具有持續(xù)的生長增殖信號、對抗生長信號的不敏感性、抵抗細胞死亡、無限的復制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤和轉(zhuǎn)移、避免免疫摧毀、促腫瘤的炎癥反應、以及基因組不穩(wěn)定等顯著性特征。腫瘤能量代謝的重組在過去十年受到廣泛的重視和深入的研究,并且被認為是腫瘤之十大顯著性特征之一。能量作為維持細胞生長最重要的因素,對于腫瘤細胞旺盛的生長需求尤為重要。所以能量代謝也被認為是腫瘤細胞最為薄弱的環(huán)節(jié),以能量代謝作為突破口,可能是攻克腫瘤最為有效的治療策略。作為能量代謝中最為重要的糖代謝,無疑在腫瘤研究中受到了高度的重視,而與糖代謝相關的酶則成為研究的熱點。糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)蛋白分子屬α-淀粉酶家族成員,在人類細胞中主要參與糖原分支的形成,是糖原形成過程中的主要酶之一。通常認為,糖原分支的形成,一方面增加了糖原水溶性,有利于其貯存;另則可以為糖原結合蛋白提供對接位點,包括糖原代謝相關酶類和調(diào)節(jié)蛋白等。糖原是細胞主要的能量儲存物質(zhì),在結腸癌、胃癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中,糖原的水平均顯著升高。腫瘤細胞在應對營養(yǎng)和氧氣匱乏時,糖原能夠快速地代謝,以提供能量支持,維持細胞的成活與生存。另外,糖原代謝對于蛋白翻譯后的修飾、生物合成以及抗氧化保護等,均具有重要作用。抑制腫瘤細胞糖原代謝能夠遏制磷酸戊糖途徑、核酸和脂質(zhì)的合成,以及增加活性氧簇的水平,從而引起細胞周期阻滯,誘導細胞凋亡等。所以,我們設想,能否通過抑制GBE1來抑制糖原代謝?從而阻斷膠質(zhì)瘤細胞的生長。本課題系統(tǒng)地闡述了GBE1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義,通過下調(diào)GBE1的表達研究其對膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響,并初步探討了相關的分子機制。1.GBE1蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義作者采用組織免疫化學染色、Western blotting和PCR技術,對118例人腦膠質(zhì)瘤組織和10例非腫瘤人腦組織的GBE1蛋白表達水平和m RNA水平進行了分析,首次證實了GBE1在膠質(zhì)瘤中存在過表達的狀況。隨后,比較分析了GBE1在各病理類型和級別的表達情況。研究發(fā)現(xiàn),GBE1在正常人腦組織中的表達水平低,而在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯增高,并且在細胞核和細胞漿中均有表達。根據(jù)WHO分級和病理分型統(tǒng)計結果顯示,除外WHOⅠ級和毛細胞型星形細胞瘤外,其余各級別和各病理類型膠質(zhì)瘤中GBE1均存在過表達現(xiàn)象,并且其表達水平的高低與腫瘤惡性程度相關。本實驗對納入的118例膠質(zhì)瘤患者進行了隨訪和臨床相關資料的收集,并結合GBE1的IRS評分,分析了其與患者生存期及臨床資料的關系。Mann-Whitney秩和檢驗結果顯示,GBE1的IRS與患者的性別、年齡和腫瘤的大小之間無明顯相關性。Kaplan-Meier生存曲線結果表明,GBE1蛋白表達較高和較低的兩組膠質(zhì)瘤患者,中位生存期分別為約14和33個月。Log-rank檢驗提示,GBE1表達較高的膠質(zhì)瘤患者生存期更短(p0.05)�；颊呱鏁r間多因素Cox回歸分析結果顯示,膠質(zhì)瘤的病理級別和GBE1的IRS水平是判斷患者預后的獨立因素(p0.05)。另外,作者利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)母細胞瘤基因表達譜數(shù)據(jù)和相關臨床資料對GBE1的m RNA表達水平和預后的影響進行了分析。相對于正常腦組織,GBE1在膠質(zhì)母細胞瘤中存在過表達狀況。Kaplan-Meier結果證明,膠質(zhì)母細胞瘤患者中GBE1基因表達水平較高組與表達水平較低組之間的總體生存率具有明顯的差異,GBE1-m RN A表達水平較高的患者,其生存期更短(p0.05)。有關膠質(zhì)母細胞瘤患者生存期的Cox比例風險模型多因素分析結果提示,MGMT啟動子甲基化水平、GBE1-m RN A表達水平和年齡,是影響膠質(zhì)母細胞瘤患者生存率的獨立預后因素。所以,檢測GBE1的表達水平,并結合MGMT啟動子甲基化水平、病理級別和年齡因素等進行綜合考慮分析,對于判斷膠質(zhì)瘤患者的預后具有一定的意義。2.抑制GBE1的表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響本部分實驗以人腦膠質(zhì)瘤U251細胞為研究對象,通過RNAi技術下調(diào)U251細胞中GBE1的表達水平之后,觀察細胞在生長與增殖、凋亡和遷移侵襲能力等方面的影響。MTT法檢測結果顯示,下調(diào)GBE1基因的表達水平能夠明顯地抑制U251細胞的活力(p0.05)。采用平板克隆形成實驗進行觀察,當下調(diào)GBE1的表達時,能夠明顯地抑制U251的體外增殖能力(p0.05)。細胞分裂周期檢測結果亦表明,下調(diào)GBE1的表達能夠引起U251細胞S期阻滯(p0.05),明顯地抑制了細胞分裂周期的進展。從流式細胞凋亡檢測結果分析,下調(diào)GBE1基因的表達能夠顯著地誘導U251細胞調(diào)亡的發(fā)生(p0.05)。另外,從單層細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗觀察到,下調(diào)GBE1基因的表達能夠明顯地抑制U251細胞的體外遷移和侵襲能力(p0.05)。綜合上述實驗結果,作者認為GBE1在膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展過程之中發(fā)揮了一定的促進作用,以GBE1基因為靶點,下調(diào)其在膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平,可在一定程度上達到抑制腫瘤增殖和侵襲的效果。3.初步探討GBE1對膠質(zhì)瘤細胞凋亡和侵襲相關分子的影響及其潛在的調(diào)控機制作者通過Western blotting方法,檢測了膠質(zhì)瘤U251細胞經(jīng)GBE1-RNAi后細胞凋亡和侵襲相關標志分子的表達變化。GBE1干涉組細胞中凋亡相關分子Bax和活化的caspase3表達量有顯著升高(p0.05),而Bcl-2的表達則明顯下降(p0.05);細胞侵襲相關分子MT1-MMP表達量明顯下降(p0.05),但MMP-2的表達量未見有統(tǒng)計學意義的改變(p0.05)。根據(jù)TCGA中的膠質(zhì)母細胞瘤基因表達數(shù)據(jù)進行相關性分析顯示,Wnt信號通路關鍵的調(diào)控分子β-catenin、細胞周期相關分子c-MYC、侵襲相關分子MT1-MMP、低氧誘導因子HIF-1、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、以及糖原合成酶GYS與GBE1之間均存在明顯的表達相關性(p0.05)。Western blotting和細胞免疫化學檢測的結果呈現(xiàn),下調(diào)GBE1在U251細胞中的表達能夠引起β-catenin的蛋白表達水平下降,同時抑制了β-catenin的核轉(zhuǎn)移水平。因而推測,β-catenin轉(zhuǎn)錄水平的降低是GBE1-RNAi引起膠質(zhì)瘤U251細胞生物學行為改變的機制之一。最后,通過Western blotting和PCR技術方法檢測了低氧對膠質(zhì)瘤細胞GBE1表達水平的影響。結果發(fā)現(xiàn),在低氧環(huán)境下,GBE1的m RNA和蛋白表達水平在U251、U87和SHG44細胞中均有顯著性增高(p0.05)。綜合上述實驗結果,作者認為,GBE1在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起到了重要的促進作用。GBE1不但對判斷膠質(zhì)瘤患者的預后具有一定的意義,同時它可能成為一個潛在的基因治療靶點,這為膠質(zhì)瘤患者的個體化治療提供了一種新的選擇。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

圖 0-1 腫瘤組織構成示意圖[27]腫瘤的起始可能由單個基因或蛋白分子的異常而引發(fā)，但腫瘤的發(fā)展往往涉基因和蛋白分子異常事件的積累[29-31]，所以不難理解在同一膠質(zhì)母細胞瘤中出現(xiàn)表皮生長因子受體、血小板源性生長因子受體和受體酪氨酸激酶等多基事件的共存[32, 33]。實際上，腫瘤是由不同的基因突變、不同的表型和不同的傳學特征的多種腫瘤亞型的細胞組成[34]（如圖 0-2）。Andrea 等對來自同一膠胞瘤的不同位點的標本組織進行了 DNA 拷貝數(shù)和基因表達譜的分析，結果同一腫瘤組織中存在不同的腫瘤亞型，并且推斷其內(nèi)部的腫瘤細胞處于動態(tài)35]。Patel等對膠質(zhì)母細胞瘤進行原代培養(yǎng)，并獲得單個腫瘤細胞，通過對單細胞 RNA 檢測發(fā)現(xiàn)，同一腫瘤中含多種不同基因表達譜的腫瘤細胞，并證實的這種異質(zhì)性與患者預后密切相關，即異質(zhì)性越大，患者預后越差[36]。Eva現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤中存在氧氣濃度的區(qū)域差異，分輕、中、重度缺氧區(qū)和非

圖0-2腫瘤異質(zhì)性形成理論模型圖

圖0-3膠質(zhì)母細胞瘤結構異質(zhì)性示意圖
【共引文獻】

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本文編號：2855737