膠質(zhì)瘤是較為常見的原發(fā)性腦腫瘤,約占40%,5年生存率約為20-30%。其中,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高,約占膠質(zhì)瘤的50%,年發(fā)生率為3/100,000-4/100,000人口。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性強(qiáng),復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差,中位生存時(shí)間約14.6個(gè)月,3年生存率約為16%,5年生存率不到2%。近年來,雖然治療策略和技術(shù)獲得了不斷的進(jìn)步,但是此類患者的生存期和生存率并沒有明顯的提高。深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制、并探索關(guān)鍵的分子靶點(diǎn),將有助于突破膠質(zhì)瘤治療的瓶頸,進(jìn)一步改善患者的預(yù)后。腫瘤細(xì)胞具有持續(xù)的生長增殖信號(hào)、對(duì)抗生長信號(hào)的不敏感性、抵抗細(xì)胞死亡、無限的復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤和轉(zhuǎn)移、避免免疫摧毀、促腫瘤的炎癥反應(yīng)、以及基因組不穩(wěn)定等顯著性特征。腫瘤能量代謝的重組在過去十年受到廣泛的重視和深入的研究,并且被認(rèn)為是腫瘤之十大顯著性特征之一。能量作為維持細(xì)胞生長最重要的因素,對(duì)于腫瘤細(xì)胞旺盛的生長需求尤為重要。所以能量代謝也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞最為薄弱的環(huán)節(jié),以能量代謝作為突破口,可能是攻克腫瘤最為有效的治療策略。作為能量代謝中最為重要的糖代謝,無疑在腫瘤研究中受到了高度的重視,而與糖代謝相關(guān)的酶則成為研究的熱點(diǎn)。糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)蛋白分子屬α-淀粉酶家族成員,在人類細(xì)胞中主要參與糖原分支的形成,是糖原形成過程中的主要酶之一。通常認(rèn)為,糖原分支的形成,一方面增加了糖原水溶性,有利于其貯存;另則可以為糖原結(jié)合蛋白提供對(duì)接位點(diǎn),包括糖原代謝相關(guān)酶類和調(diào)節(jié)蛋白等。糖原是細(xì)胞主要的能量儲(chǔ)存物質(zhì),在結(jié)腸癌、胃癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中,糖原的水平均顯著升高。腫瘤細(xì)胞在應(yīng)對(duì)營養(yǎng)和氧氣匱乏時(shí),糖原能夠快速地代謝,以提供能量支持,維持細(xì)胞的成活與生存。另外,糖原代謝對(duì)于蛋白翻譯后的修飾、生物合成以及抗氧化保護(hù)等,均具有重要作用。抑制腫瘤細(xì)胞糖原代謝能夠遏制磷酸戊糖途徑、核酸和脂質(zhì)的合成,以及增加活性氧簇的水平,從而引起細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。所以,我們?cè)O(shè)想,能否通過抑制GBE1來抑制糖原代謝?從而阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。本課題系統(tǒng)地闡述了GBE1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義,通過下調(diào)GBE1的表達(dá)研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并初步探討了相關(guān)的分子機(jī)制。1.GBE1蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義作者采用組織免疫化學(xué)染色、Western blotting和PCR技術(shù),對(duì)118例人腦膠質(zhì)瘤組織和10例非腫瘤人腦組織的GBE1蛋白表達(dá)水平和m RNA水平進(jìn)行了分析,首次證實(shí)了GBE1在膠質(zhì)瘤中存在過表達(dá)的狀況。隨后,比較分析了GBE1在各病理類型和級(jí)別的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),GBE1在正常人腦組織中的表達(dá)水平低,而在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯增高,并且在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)。根據(jù)WHO分級(jí)和病理分型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,除外WHOⅠ級(jí)和毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤外,其余各級(jí)別和各病理類型膠質(zhì)瘤中GBE1均存在過表達(dá)現(xiàn)象,并且其表達(dá)水平的高低與腫瘤惡性程度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)納入的118例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行了隨訪和臨床相關(guān)資料的收集,并結(jié)合GBE1的IRS評(píng)分,分析了其與患者生存期及臨床資料的關(guān)系。Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示,GBE1的IRS與患者的性別、年齡和腫瘤的大小之間無明顯相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明,GBE1蛋白表達(dá)較高和較低的兩組膠質(zhì)瘤患者,中位生存期分別為約14和33個(gè)月。Log-rank檢驗(yàn)提示,GBE1表達(dá)較高的膠質(zhì)瘤患者生存期更短(p0.05)�；颊呱鏁r(shí)間多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別和GBE1的IRS水平是判斷患者預(yù)后的獨(dú)立因素(p0.05)。另外,作者利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床資料對(duì)GBE1的m RNA表達(dá)水平和預(yù)后的影響進(jìn)行了分析。相對(duì)于正常腦組織,GBE1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在過表達(dá)狀況。Kaplan-Meier結(jié)果證明,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中GBE1基因表達(dá)水平較高組與表達(dá)水平較低組之間的總體生存率具有明顯的差異,GBE1-m RN A表達(dá)水平較高的患者,其生存期更短(p0.05)。有關(guān)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果提示,MGMT啟動(dòng)子甲基化水平、GBE1-m RN A表達(dá)水平和年齡,是影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。所以,檢測(cè)GBE1的表達(dá)水平,并結(jié)合MGMT啟動(dòng)子甲基化水平、病理級(jí)別和年齡因素等進(jìn)行綜合考慮分析,對(duì)于判斷膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后具有一定的意義。2.抑制GBE1的表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響本部分實(shí)驗(yàn)以人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為研究對(duì)象,通過RNAi技術(shù)下調(diào)U251細(xì)胞中GBE1的表達(dá)水平之后,觀察細(xì)胞在生長與增殖、凋亡和遷移侵襲能力等方面的影響。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,下調(diào)GBE1基因的表達(dá)水平能夠明顯地抑制U251細(xì)胞的活力(p0.05)。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察,當(dāng)下調(diào)GBE1的表達(dá)時(shí),能夠明顯地抑制U251的體外增殖能力(p0.05)。細(xì)胞分裂周期檢測(cè)結(jié)果亦表明,下調(diào)GBE1的表達(dá)能夠引起U251細(xì)胞S期阻滯(p0.05),明顯地抑制了細(xì)胞分裂周期的進(jìn)展。從流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果分析,下調(diào)GBE1基因的表達(dá)能夠顯著地誘導(dǎo)U251細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生(p0.05)。另外,從單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到,下調(diào)GBE1基因的表達(dá)能夠明顯地抑制U251細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力(p0.05)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者認(rèn)為GBE1在膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展過程之中發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用,以GBE1基因?yàn)榘悬c(diǎn),下調(diào)其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,可在一定程度上達(dá)到抑制腫瘤增殖和侵襲的效果。3.初步探討GBE1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和侵襲相關(guān)分子的影響及其潛在的調(diào)控機(jī)制作者通過Western blotting方法,檢測(cè)了膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞經(jīng)GBE1-RNAi后細(xì)胞凋亡和侵襲相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)變化。GBE1干涉組細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子Bax和活化的caspase3表達(dá)量有顯著升高(p0.05),而Bcl-2的表達(dá)則明顯下降(p0.05);細(xì)胞侵襲相關(guān)分子MT1-MMP表達(dá)量明顯下降(p0.05),但MMP-2的表達(dá)量未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(p0.05)。根據(jù)TCGA中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示,Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵的調(diào)控分子β-catenin、細(xì)胞周期相關(guān)分子c-MYC、侵襲相關(guān)分子MT1-MMP、低氧誘導(dǎo)因子HIF-1、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、以及糖原合成酶GYS與GBE1之間均存在明顯的表達(dá)相關(guān)性(p0.05)。Western blotting和細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果呈現(xiàn),下調(diào)GBE1在U251細(xì)胞中的表達(dá)能夠引起β-catenin的蛋白表達(dá)水平下降,同時(shí)抑制了β-catenin的核轉(zhuǎn)移水平。因而推測(cè),β-catenin轉(zhuǎn)錄水平的降低是GBE1-RNAi引起膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生物學(xué)行為改變的機(jī)制之一。最后,通過Western blotting和PCR技術(shù)方法檢測(cè)了低氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GBE1表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在低氧環(huán)境下,GBE1的m RNA和蛋白表達(dá)水平在U251、U87和SHG44細(xì)胞中均有顯著性增高(p0.05)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者認(rèn)為,GBE1在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起到了重要的促進(jìn)作用。GBE1不但對(duì)判斷膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后具有一定的意義,同時(shí)它可能成為一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn),這為膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體化治療提供了一種新的選擇。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

圖 0-1 腫瘤組織構(gòu)成示意圖[27]腫瘤的起始可能由單個(gè)基因或蛋白分子的異常而引發(fā)，但腫瘤的發(fā)展往往涉基因和蛋白分子異常事件的積累[29-31]，所以不難理解在同一膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中出現(xiàn)表皮生長因子受體、血小板源性生長因子受體和受體酪氨酸激酶等多基事件的共存[32, 33]。實(shí)際上，腫瘤是由不同的基因突變、不同的表型和不同的傳學(xué)特征的多種腫瘤亞型的細(xì)胞組成[34]（如圖 0-2）。Andrea 等對(duì)來自同一膠胞瘤的不同位點(diǎn)的標(biāo)本組織進(jìn)行了 DNA 拷貝數(shù)和基因表達(dá)譜的分析，結(jié)果同一腫瘤組織中存在不同的腫瘤亞型，并且推斷其內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)35]。Patel等對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行原代培養(yǎng)，并獲得單個(gè)腫瘤細(xì)胞，通過對(duì)單細(xì)胞 RNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同一腫瘤中含多種不同基因表達(dá)譜的腫瘤細(xì)胞，并證實(shí)的這種異質(zhì)性與患者預(yù)后密切相關(guān)，即異質(zhì)性越大，患者預(yù)后越差[36]。Eva現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在氧氣濃度的區(qū)域差異，分輕、中、重度缺氧區(qū)和非

圖0-2腫瘤異質(zhì)性形成理論模型圖

圖0-3膠質(zhì)母細(xì)胞瘤結(jié)構(gòu)異質(zhì)性示意圖
【共引文獻(xiàn)】

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