發(fā)布時(shí)間：2020-10-26 02:56

　　 乳腺癌一直是威脅女性健康的一大因素。在我國(guó),乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),并且越來(lái)越趨于年輕化。因此,闡明乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制,鑒定出一系列有價(jià)值的臨床標(biāo)志物,將有助于乳腺癌的臨床診斷和藥物治療。乳腺癌的誘發(fā)因素有很多,其中雌激素暴露被證實(shí)同乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移存在直接的聯(lián)系。雌激素受體α(EstrogenReceptorα,ERα)是細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)雌激素刺激并且介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子,同時(shí)ERα也是臨床上重要的藥物靶點(diǎn)。然而,參與并調(diào)節(jié)雌激素-ERα通路的分子和信號(hào)非常復(fù)雜,并且隨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的差異呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。因此,闡明雌激素信號(hào)通路和ERα功能的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。檢查點(diǎn)抑制因子1(Checkpoint Suppressor 1,CHES1)最早在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)參與DNA損傷應(yīng)答和細(xì)胞周期阻滯,因其包含有保守的叉頭盒(Forkheadbox,FOX)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,也叫FOXN3。之后的研究發(fā)現(xiàn),CHES1可以參與蛋白質(zhì)合成、葡萄糖代謝和胚胎發(fā)育等過(guò)程,并且被證實(shí)可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明CHES1同多種類(lèi)型癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在密切的聯(lián)系。數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明CHES1可能發(fā)揮腫瘤抑制作用,并且其在乳腺癌中處于低表達(dá)狀態(tài)。因此,本研究從蛋白分子間相互作用入手,在分子水平探究CHES1同雌激素信號(hào)通路之間的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)理,以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和成瘤作用的影響。本研究的主要內(nèi)容如下:(1)免疫共沉淀、免疫熒光以及GST-pulldown等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在乳腺癌細(xì)胞中,CHES1同ERα存在直接的相互作用,并且進(jìn)一步鑒定出兩者相互作用所依賴(lài)的結(jié)構(gòu)域。(2)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和反轉(zhuǎn)錄PCR等結(jié)果顯示,CHES1可以作為ERα的轉(zhuǎn)錄輔抑制因子抑制ERα雌激素依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活性,并且可以抑制ERα下游靶基因CCND1、c-Myc以及pS2的mRNA和蛋白表達(dá)。(3)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究了CHES1抑制ERα轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制。蛋白免疫印跡以及免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHES1并不影響ERα的蛋白穩(wěn)定性、二聚化以及亞細(xì)胞定位,并且不會(huì)影響ERα同組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)HDAC1和HDAC2的相互作用;深入研究發(fā)現(xiàn)CHES1可以通過(guò)招募去乙�；窼IRT1促進(jìn)ERα的去乙酰化過(guò)程,進(jìn)而抑制ERα在下游靶基因啟動(dòng)子上的富集和轉(zhuǎn)錄激活。(4)蛋白免疫印跡和免疫組化結(jié)果證實(shí)CHES1在ERα陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中處于低表達(dá)狀態(tài),在ERα陰性的乳腺癌中處于高表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),在CHES1啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)保守的雌激素結(jié)合元件(Estrogenresponseelement,ERE),染色質(zhì)免疫共沉淀和實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)顯示,ERα可以響應(yīng)雌激素的刺激識(shí)別ERE基序并結(jié)合到CHES1啟動(dòng)子上抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。利用數(shù)據(jù)庫(kù)分析對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中CHES1同ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。(5)通過(guò)細(xì)胞增殖和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CHES1在體外特異性抑制ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,通過(guò)構(gòu)建小鼠模型證實(shí)CHES1在體內(nèi)顯著抑制ERα陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞的成瘤能力。生物信息學(xué)分析表明CHES1的表達(dá)同乳腺癌病人的生存率緊密相關(guān)。綜上所述,本研究揭示了在乳腺癌細(xì)胞中CHES1同雌激素信號(hào)通路之間存在相互調(diào)節(jié)的作用,這種作用共同參與ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和乳腺癌細(xì)胞增殖和成瘤過(guò)程。此外,本研究也探究了 CHES1在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能,為乳腺癌的臨床診斷和藥物設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.9
【部分圖文】：

作用于其他器官，在維持骨密度、防止骨質(zhì)疏松，降低膽固醇水平、保護(hù)心血管系統(tǒng)以??及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、認(rèn)知行為的調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮不可或缺的作用。在女性體內(nèi)，??存在四種天然的雌激素（圖１．２），分別是雌素酮（Ｅｓｔｒｏｎ，Ｅｉ）、雌二醇（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）、??雌三醇（Ｅｓｔｒｉｏｌ，?Ｅ３）和雌四醇（Ｅｓｔｅｔｒｏｌ，?Ｅ４）?［４］。??Ｅ，?Ｅｓｔｒｏｎｅ?Ｅ２?Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ??Ｅｊ?Ｅｓｔｒｉｏｌ?Ｅ４?Ｅｓｔｅｔｒｏｌ??圖１．２四種雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｔｈｅ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｆｏｕｒ?ｅｓｔｒｏｇｅｎ??四種類(lèi)型的雌激素分別存在于不同的生理時(shí)期，其中ｅ２是最廣泛的存在形式，在??女性整個(gè)生育期間一直存在于血清并且可以有效激活雌激素信號(hào)通路。因此，ｅ２是雌激??素發(fā)揮功能的主要形式，也是后期臨床藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。??自然界中，少數(shù)的昆蟲(chóng)和幾乎所有的脊椎動(dòng)物均可以分泌雌激素，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)??雌激素由生殖器官如卵巢或胎盤(pán)合成并分泌到血液中，雄激素如睪酮和雄烯二酮也可以??通過(guò)芳香化酶（ａｒｏｍａｔａｓｅ）轉(zhuǎn)化為雌激素［３１］。雌激素分泌之后

ｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｅｓｔｒｏｇｅｎ?ｓｉｇｎａｌ?ｐａｔｈｗ素信號(hào)通路還可以通過(guò)雌激素非依賴(lài)的方式激活，細(xì)胞膜上的?ｆａｃｔｏｒ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ＧＦＲｓ）如表皮生長(zhǎng)因子受體（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ?ｇｒｏ）和類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子受體（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，?Ｉ刺激后，可以直接活化ＥＲＫ和ＡＫＴ色氨酸／酪氨酸激酶，這些激飾，活化ＥＲａ激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［３３，３４］。雌激素信號(hào)通路的經(jīng)典的下游靶基因包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子（如ＣＣＡ？八；？２八ｃ－Ｍ５ＣＬ２、５ＣＬＺＬ）、細(xì)胞黏附分子（ＳＭ４／八見(jiàn)ｔ／Ｇ）、炎癥反應(yīng)生成分子（如嗯ＧＦ）等［３５］。??調(diào)節(jié)因子??雌激素刺激之后，發(fā)生二聚化作用進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)入核識(shí)別下游靶基因序列，ＥＲａ的ＤＢＤ結(jié)構(gòu)域中包含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，靠近Ｎ識(shí)別ＥＲＥ基序（ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ，?ｎ代表任意堿基）（圖１．４穩(wěn)定ＥＲａ同非特異性ＤＮＡ分子之間的相互作用。ＥＲａ占據(jù)啟

（１）?ＥＲａ轉(zhuǎn)錄輔激活因子：??ＥＲａ互作的轉(zhuǎn)錄輔激活因子有很多種類(lèi)，包括最經(jīng)典的ｐｌ６０家族、先鋒因子??ｅｅｒ?ｆａｃｔｏｒｓ）、ＡＴＰ依賴(lài)的輔激活因子以及具有特定酶活性的輔因子（圖１．５）。??家族是核受體最經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，包含有三個(gè)成員：ＳＲＣ１、ＧＲＩＰ１［３６＃Ｄ??７，３８］。該家族成員均包含有同ＥＲａ互作所必需的ＬｘｘＬＬ氨基酸基序（ｘ代表任意??），當(dāng)雌激素同ＥＲａ相結(jié)合時(shí)，ＥＲａＡＦ２結(jié)構(gòu)域同ｐｌ６０家族蛋白的ＬｘｘＬＬ基序??，使ＥＲａ蛋白結(jié)構(gòu)變成更加開(kāi)放的構(gòu)象，促進(jìn)了?ＥＲａ同其他輔激活因子和ＤＮＡ??，進(jìn)而加速轉(zhuǎn)錄起始［３９］。ＣｈＩＰ實(shí)驗(yàn)結(jié)果己經(jīng)證實(shí)，在體內(nèi)ＥＲａ和ｐｌ６０輔激活因??游靶基因ＣＴ５Ｄ?（ｃａ決Ｄ）和戶(hù)幻啟動(dòng)子上呈現(xiàn)周期性動(dòng)態(tài)結(jié)合和解聚，使??結(jié)構(gòu)持續(xù)保持開(kāi)放狀態(tài)，促進(jìn)了靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄激活（圖１．６）。??ＡＦ－１?ＡＦ－２??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??３５８?３６２??１１８?１６７?３５１＾?［３７６?５４０??｜?！?｜?￣?＂１?￣?Ｉ??一?Ａ／Ｂ?■?Ｃ?４?Ｄ?｝?Ｅ?■?Ｆ?卜??
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