發(fā)布時間：2020-10-23 04:01

　　 目的:肺癌是最常見的腫瘤相關(guān)性死亡原因,全球的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌病例的80-85%,大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者診斷為晚期,因為他們在早期通常無明顯癥狀,總體的5年生存率仍然是大約16%。因此,深入研究非小細(xì)胞肺癌的分子機(jī)制和特異性診斷標(biāo)志物十分重要,有利于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷及治療。人類轉(zhuǎn)錄基因組不僅包含編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(mRNA),而且還包含大量具有結(jié)構(gòu)功能、調(diào)節(jié)功能或功能未知的不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄子。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一類(長度大于200nt,蛋白質(zhì)編碼潛力有限的)非編碼RNAs,lncRNAs已被證明在細(xì)胞生物學(xué)的各個方面扮演重要角色。一些lncRNAs已經(jīng)證明在細(xì)胞發(fā)育、分化和許多其他生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。此外,一些研究已發(fā)現(xiàn)lncRNAs在各種類型的人類疾病特別是癌癥中出現(xiàn)失調(diào)。然而,盡管十多年的研究使得人們在了解lncRNAs上已經(jīng)有了巨大的進(jìn)步,但是大多數(shù)lncRNAs的具體的功能仍然是未知的。Wnt/β-catenin信號通路是已被公認(rèn)的在調(diào)控腫瘤形成和轉(zhuǎn)移發(fā)揮至關(guān)重要作用的信號通路,在人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和組織中可檢測到異常激活的Wnt信號占50%。越來越多的證據(jù)顯示,lncRNAs是Wnt/β-catenin信號通路的重要調(diào)節(jié)器。糖原合酶kinase-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是Wnt/β-catenin信號通路的一種關(guān)鍵蛋白,可磷酸化β-catenin并導(dǎo)致其降解。這里我們首先檢測長鏈非編碼RNA-222(long intergenic non-protein coding RNA222,LINC00222)在非小細(xì)胞肺癌樣本、相鄰癌旁正常肺組織的表達(dá)情況,LINC00222已被證明在肝母細(xì)胞癌組織中低表達(dá)。過表達(dá)LINC00222可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,但可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然后我們通過RPISeq軟件(URL http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/results.php)預(yù)測到LINC00222可能與GSK-3β蛋白結(jié)合,進(jìn)一步驗證LINC00222如何通過GSK-3β來調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。我們的研究結(jié)果為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了一個新的思路。研究方法:1、實驗材料:(1)非小細(xì)胞肺癌新鮮冰凍組織。(2)非小細(xì)胞肺癌A549、LTEP-a-2細(xì)胞系。(3)Real-time PCR實驗所需試劑、儀器。(4)Western Blot實驗所需試劑、儀器。(5)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、儀器。(6)LINC00222表達(dá)載體:pCDNA-LINC00222。(7)GSK-3β活性抑制劑TWS119。(8)RNA-CHIP相關(guān)試劑、設(shè)備。2、實驗方法:(1)Real-time PCR方法檢測新鮮冰凍非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中LINC00222的RNA表達(dá)水平,檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及正常肺胚細(xì)胞系中LINC00222表達(dá)。(2)將LINC00222表達(dá)水平與研究對象預(yù)后指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行分析,驗證LINC00222表達(dá)是否與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)。(3)構(gòu)建LINC00222全長表達(dá)載體pCDNA-LINC00222,轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、LTEP-a-2。(4)利用CCK-8、PI凋亡實驗鑒定LINC00222在增殖、凋亡中的作用。(5)利用transwell、劃線實驗技術(shù)鑒定LINC00222在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲種的作用。(6)利用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞GSK-3β磷酸化蛋白水平變化,鑒定GSK-3β活性是否改變。(7)利用Western Blot檢測細(xì)胞核β-catenin蛋白表達(dá),驗證LINC00222能否影響β-catenin磷酸化而導(dǎo)致核轉(zhuǎn)位異常;加入GSK-3β活性抑制劑(TWS119),鑒定β-catenin蛋白表達(dá)是否回調(diào)。(8)利用RNA-蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(RNA-CHIP,RIP)鑒定LINC00222是否可與GSK-3β蛋白直接相互作用。結(jié)果:1、相對于鄰近的正常肺組織,LINC00222在85%(88/103)的非小細(xì)胞肺癌樣本中明顯低表達(dá)。2、相對于MRC-5細(xì)胞,LINC00222在A549和LTEP-a-2細(xì)胞中表達(dá)明顯降低。3、LINC00222低表達(dá)組的患者有較高的復(fù)發(fā)率(DFS中位數(shù):16個月)和更短的總生存期(OS中位數(shù):22個月)比LINC00222高表達(dá)組(DFS中位數(shù):24個月;操作系統(tǒng)中位數(shù):31個月;分別為p=0.0139和0.0189)。4、LINC00222 NSCLC患者顯著的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM階段,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。5、LINC00222 upregulation抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖,但凋亡。6、LINC00222upregulation抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和入侵。7、高表達(dá)的LINC00222可降低GSK-3β磷酸化水平,意味著其增強(qiáng)了GSK-3β的活性。8、細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222后,細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白質(zhì)水平的表達(dá)明顯降低,在加入TWS119后,細(xì)胞核β-catenin蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)回復(fù)。9、RIP結(jié)果提示通LINC00222可與GSK-3β蛋白直接結(jié)合。結(jié)論:我們的研究數(shù)據(jù)表明LINC00222在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá),LINC00222可抑制NSCLC細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)移和侵襲,但促進(jìn)凋亡,與Wnt/β-catenin相關(guān)信號通路密切相關(guān)。為非小細(xì)胞肺癌治療提出了一個新的研究方向。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

圖 3.1 LINC00222 在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系(A) Real-time PCR 檢測 LINC00222 在 103 對 NSCLC 癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)，結(jié)果比對 GAPDH。(B) Real-time PCR 檢測 LINC00222 在 A549、LTEP-a-2 細(xì)胞中表達(dá)。所有實驗重復(fù) 3 次。(C) Kaplan-Meier 生存曲線分析無進(jìn)展生存期(DFS)，LINC00222 表達(dá)和患者相關(guān)性。(D) Kaplan-Meie 生存曲線分析總生存期(OS)，LINC00222 表達(dá)和患者相關(guān)性。*P < 0.05, **P < 0.01.Figure 3.1 The expression of LINC00222 in NSCLC tussues and cells and the relationship with prognosis.(A) Relative LINC00222 expression in 103 paired NSCLC samples and adjacent normal lung tissues wasexamined by Real-time quantitative PCR and normalized to GAPDH expression. (B) Relative LINC00222expression in A549 and LTEP-a-2 cells by Real-time quantitative PCR. Data are presented as mean ±SD obtainedfrom three independent experiments. (C) Kaplan-Meier survival analysis on disease-free survival (DFS) of thecorrelation of LINC00222 expression and patient survival. (D) Kaplan-Meier survival analysis on overall survival(OS) of the correlation of LINC00222 expression and patient survival. *P < 0.05, **P < 0.01.3.2 LINC00222 的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.3 LINC00222 抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡為了證實 LINC00222 對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，我們首先構(gòu)建 LINC00222 表達(dá)載體 pCDNA-LINC00222，分別轉(zhuǎn)染 A549 及 LTEP-a-2 細(xì)胞系 pCDNA-LINC00222 及 empty vector 載體。Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)LINC00222 表達(dá)情況，結(jié)果顯示相較轉(zhuǎn)染 empty vector 載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 載體后 LINC00222 RNA 表達(dá)水平明顯提高，證實了轉(zhuǎn)染效率較高（圖 A）。利用 CCK-8 試劑盒，分別檢測細(xì)胞酶標(biāo)儀分別測定細(xì)胞 1h，24h，48h，72h，96h 時在 450nm 處的吸光度。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染 pCDNA-LINC00222載體后，A549 及 LTEP-a-2 細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制（圖 B, C）。利用 Hoechst33342/PI 染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染 pCDNA-LINC00222 載體后，A549 及 LTEP-a-2 細(xì)胞凋亡明顯增加（圖 D, E）。

圖 3.3 LINC00222 對 NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的影響(A, B) 利用劃痕實驗分析檢測轉(zhuǎn)染 pCDNA-LINC00222 后 A549、LTEP-a-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。(C, D) 利用帶有基底膜基質(zhì) Transwell 方法檢測轉(zhuǎn)染 pCDNA-LINC00222 后 A549、LTEP-a-2 細(xì)胞侵襲能力。所有實驗重復(fù) 3 次。*P < 0.05, **P < 0.01.Figure 3.3 Effects of LINC00222 on NSCLC cell migration and invasion in vitro.(A, B) Wound-healing assay were used to determine the cell migration for pCDNA-LINC00222transfected A549 and LTEP-a-2 cells. (C, D) Transwell assay with Matrigel were used to determine the cellinvasion for pCDNA-LINC00222-transfected A549 and LTEP-a-2 cells. Values represented from threeindependent experiments. *P < 0.05 and **P < 0.01.
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