乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,絕大多數(shù)系源于乳腺的上皮組織,少數(shù)可源自乳房的各種非上皮組織,偶爾可見到混合性的癌肉瘤。據(jù)Globocan統(tǒng)計(jì),2008年全球女性乳腺癌新診斷病例達(dá)138萬例,占全部女性惡性腫瘤發(fā)病率的23%,已成為威脅婦女健康的主要病因。目前在中國,每年有超過120萬人因癌癥而死亡。而乳腺癌則成為了中國女性發(fā)病率最高的癌癥,在癌癥死亡原因中位居第六；中國每年乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%。中國全年檢查出的乳腺癌患者數(shù)量是歐洲的一半,與美國基本相當(dāng)。在過去30至40年中,惡性腫瘤死亡率在城市人群中的增長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)村。如果保持這一趨勢不變,那么到2021年,中國乳腺癌患者將會(huì)高達(dá)250萬,發(fā)病率可能將會(huì)增加一倍。為此,我國在2012年啟動(dòng)了城市癌癥早診早治項(xiàng)目,擬在全國9個(gè)大區(qū)的14個(gè)省份針對城市高發(fā)的五大類癌癥(肺癌、結(jié)直腸癌、上消化道癌、乳腺癌和肝癌)開展危險(xiǎn)因素調(diào)查和高危人群評估、癌癥篩查和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評估工作。乳腺癌是一種全身性的疾病,在疾病的早期就有可能發(fā)生腫瘤細(xì)胞的全身擴(kuò)散。乳腺癌治療失敗的原因幾乎為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其主要轉(zhuǎn)移途徑為血行播散,乳腺癌細(xì)胞可以通過上述途徑到達(dá)機(jī)體的任一組織和器官,并在一定條件下形成轉(zhuǎn)移灶。一般腫瘤在小于1 cm的情況下,醫(yī)生并不會(huì)認(rèn)為它是異常。但通過國外發(fā)表的文章可知,不要說是1 cm,很多腫瘤在1 mm的情況下就能夠在血液里檢查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞。因此對于早期診斷來講,乳腺癌高危因素的預(yù)測并通過日常生活中有效的預(yù)防,就顯得更加有意義。正因?yàn)槿绱?很多研究者都投身于乳腺癌的研究,試圖用各種方法找到乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。一些乳腺癌高發(fā)病率國家對乳腺癌發(fā)病相關(guān)危險(xiǎn)因素的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展。研究者通過對某一地區(qū)特定人群的調(diào)查與分析,確定了這一區(qū)域乳腺癌發(fā)病相關(guān)危險(xiǎn)因素。從而讓醫(yī)生能夠?qū)ο嚓P(guān)信息進(jìn)行個(gè)體化、量化來預(yù)測某一女性罹患乳腺癌危險(xiǎn)性。這已經(jīng)成為惡性腫瘤相關(guān)檢查的重要內(nèi)容。乳腺是多種內(nèi)分泌激素的靶器官,如雌激素、孕激素及泌乳素等。雌激素是乳腺細(xì)胞增殖最主要的興奮劑,黃體酮(孕酮)也會(huì)一同作用加大乳腺細(xì)胞增殖的比率。其中雌酮及雌二醇對乳腺癌的發(fā)病有直接關(guān)系。20歲前本病少見,20歲以后發(fā)病率迅速上升,45-50歲較高,絕經(jīng)后發(fā)病率繼續(xù)上升,可能與年老者雌酮含量提高相關(guān)。月經(jīng)初潮年齡早、絕經(jīng)年齡晚、不孕及初次足月產(chǎn)的年齡與乳腺癌發(fā)病均有關(guān)。一級親屬中有乳腺癌病史者,發(fā)病危險(xiǎn)性是普通人群的2-3倍。乳腺良性疾病與乳腺癌的關(guān)系尚有爭論,多數(shù)認(rèn)為乳腺小葉上皮高度增生或不典型增生者可能與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。另外,營養(yǎng)過剩、肥胖、脂肪飲食,可加強(qiáng)或延長雌激素對乳腺上皮細(xì)胞的刺激,從而增加發(fā)病機(jī)會(huì)。北美、北歐地區(qū)乳腺癌發(fā)病率約為亞、非、拉美地區(qū)的4倍,而低發(fā)地區(qū)居民移居至高發(fā)地區(qū)后,第二、三代移民的乳腺癌發(fā)病率逐漸升高,提示環(huán)境因素及生活方式與乳腺癌的發(fā)病有一定關(guān)系。除此之外,隨著近年來對基因突變與癌癥發(fā)生相關(guān)研究的不斷突破和深入,人們越來越認(rèn)識到癌癥的發(fā)生與基因突變緊密相關(guān)。研究者紛紛進(jìn)行了大量的關(guān)于癌癥發(fā)生在基因水平方面的機(jī)制研究,取得了豐碩的成果,并且逐漸應(yīng)用于癌癥的診斷、預(yù)防當(dāng)中。尤其是隨著人類測序計(jì)劃和Hap Map計(jì)劃的順利完成,各種高通量測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用,研究者可以利用全基因組關(guān)聯(lián)性分析的方法來尋找乳腺癌的易感基因。上世紀(jì)80年代,流行病學(xué)家克萊爾·金通過分析家族聚集性乳腺癌病例,認(rèn)為17號染色體的某個(gè)基因可能是導(dǎo)致乳腺癌的主要原因。1994年,美國MYRIAD公司在此基礎(chǔ)上順利地找到了BRCA1,同年該公司又利用冰島的兩個(gè)乳腺癌高發(fā)家族提供的樣本,在13號染色體上找到了BRCA2基因。目前為止,已發(fā)現(xiàn)的BRCA基因突變已達(dá)到數(shù)百種之多。但其僅限于有強(qiáng)烈遺傳家族史的人群,包括40歲之前的一級親屬患乳腺癌,50歲之前患雙側(cè)乳腺癌,任何年齡2個(gè)或2個(gè)以上一級親屬患乳腺癌。篩查較高頻率的突變形式,或?qū)ν怙@子11進(jìn)行篩查,也有篩查全部外顯子和鄰近內(nèi)含子的全序列監(jiān)測法。但是癌癥是多因素疾病,乳腺癌中BRCA只能解釋與一部分的癌癥之間的關(guān)聯(lián),且存在漏洞的可能性。因此,在判斷結(jié)果時(shí)必須綜合分析。于此同時(shí),還應(yīng)尋找其他與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制,并可應(yīng)用于高發(fā)人群的篩查、評估的標(biāo)準(zhǔn)。這對于乳腺癌的早期預(yù)測、有效預(yù)防十分必要。雖然目前高通量測序的成本已降低了不少,但是全面開展全基因組關(guān)聯(lián)分析這種需要巨大樣本量和測序通量的研究需要比較高的成本。因此本課題將研究的目標(biāo)鎖定在線粒體基因組。人線粒體DNA (mitochondrial deoxyribonucleic acid, mtDNA)是含有16.6kb的閉環(huán)雙鏈分子,有輕鏈和重鏈之分。線粒體DNA是真核細(xì)胞中唯一存在的獨(dú)立于核DNA之外的遺傳物質(zhì),與細(xì)胞的氧化磷酸化功能密切相關(guān)。它編碼氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)所需的13種氧化磷酸作用酶亞基,包括復(fù)合物Ⅰ中的七個(gè)亞基(ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6),復(fù)合物Ⅲ中的一個(gè)亞基(CytB),復(fù)合物Ⅳ中的三個(gè)亞基(COX1,COX2, COX3)以及復(fù)合物Ⅴ中的兩個(gè)亞基(ATPase6,ATPase8);同時(shí),mtDNA還可以編碼合成蛋白和生成ATP必需的22種tRNAs和兩種rRNAs。mtDNA無內(nèi)含子,唯一的非編碼區(qū)為D-loop區(qū)(displacement-region, D-loop region),該區(qū)已被證實(shí)為mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū),含有基因復(fù)制起點(diǎn)和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的啟動(dòng)子區(qū)。雖然mtDNA有自我復(fù)制能力,但產(chǎn)能過程中所需要的大多數(shù)蛋白仍然是由細(xì)胞核基因組(nuclear deoxyribonucleic acid, nDNA)所編碼的,因此稱線粒體為半自主性復(fù)制的細(xì)胞器。過去十多年的研究發(fā)現(xiàn)mtDNA的突變率很高,比nDNA高出幾十倍,突變類型有：大片段缺失、錯(cuò)義突變、移碼突變以及小片段的缺失和插入等。這主要是由其自身的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)決定的,這也導(dǎo)致它成為了眾多致癌物作用的重要靶點(diǎn)。mtDNA的突變可削弱正常的呼吸功能,釋放高水平的ROS,進(jìn)而增加腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性,所以mtDNA被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。許多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)檢測腫瘤細(xì)胞中的mtDNA突變比檢測nDNA突變要簡便可靠。臨床上針對核基因損傷的腫瘤檢測結(jié)果常達(dá)不到預(yù)期的效果,這是因?yàn)槭艿搅艘吧蚽DNA的干擾,而mtDNA在細(xì)胞中的拷貝數(shù)比nDNA高得多,比如在腫瘤細(xì)胞中突變mtDNA的拷貝數(shù)比p53基因的拷貝數(shù)高200多倍,因此檢測mtDNA突變更可靠。本研究的目的在于對乳腺癌患者人群外周血中的mtDNA突變進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)性分析來篩選具有高風(fēng)險(xiǎn)的種系突變。區(qū)別于以往研究中采用乳腺癌組織分析的體細(xì)胞突變,種系突變對于乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)人群的預(yù)測、乳腺癌的預(yù)防和早期無創(chuàng)診斷方面有著更大的意義。本研究的實(shí)驗(yàn)方法為通過隨機(jī)采集對照組(進(jìn)行全面體格檢查和影像學(xué)檢查排除各種腫瘤的體檢者)和病例組(首次病理確診為乳腺癌且從未進(jìn)行過治療的患者)外周血樣本,獲得對照組樣本137例,病例組樣本118例。提取總DNA后通過兩段擴(kuò)增法富集mtDNA,構(gòu)建片段長度為200bp的高通量測序文庫。通過Agilent 2100和Qubit 2.0對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行濃度、片段大小的測定,對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估,確定用于測序模板制備的文庫量。在Ion One Touch 2平臺(tái)上進(jìn)行測序模板的制備、富集后,使用Ion 316芯片在Ion torrent PGM測序儀上進(jìn)行高通量測序。測序數(shù)據(jù)運(yùn)用Ion Torrent PGM服務(wù)器系統(tǒng)Torrent Suite4.2自帶的分析軟件FastQC-3.4.1.1、Assembler-3.4.2.0、Alignment2.0,coverageAnalysis 3.0軟件進(jìn)行測序質(zhì)控和結(jié)果分析,對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析,去除接頭、低質(zhì)量,多克隆的序列,對原始序列進(jìn)行組裝,獲得整體數(shù)據(jù)量、平均測序深度、測序質(zhì)量等數(shù)據(jù)信息,導(dǎo)出測序fastq格式的原始數(shù)據(jù)和測序報(bào)告。運(yùn)用基于fanse2算法的云平臺(tái),與參考Homo sapiens GRCh38基因組(NC_012920)序列進(jìn)行比對,進(jìn)行變異位點(diǎn)分析及基因注釋,獲得每個(gè)樣本的突變列表。對每個(gè)突變的樣本數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)算突變頻率=有突變樣本數(shù)/總樣本數(shù)。運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對突變頻數(shù)進(jìn)行四格表資料的卡方檢驗(yàn)法分析對照組和病例組之間的差異性,同時(shí)進(jìn)行相對風(fēng)險(xiǎn)性評估,計(jì)算OR值(Odds Ratio,OR)和95%可信區(qū)間(95% confident Internal,95% CI),結(jié)合卡方檢驗(yàn)p值,分析SNP與乳腺癌疾病的關(guān)聯(lián)性,篩選高風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)指標(biāo)。篩除濾過率低于40%、mapping率低于80%、覆蓋深度低于100X或覆蓋度不均一的樣本數(shù)據(jù),最終篩選得到對照組22例和實(shí)驗(yàn)組83例有效數(shù)據(jù),平均覆蓋深度達(dá)到300X以上。測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,在22例對照組的mtDNA中發(fā)現(xiàn)170個(gè)突變位點(diǎn),而在83例乳腺癌患者的mtDNA中發(fā)現(xiàn)393個(gè)突變位點(diǎn)；我們搜索到的所有突變中有283個(gè)是未有報(bào)道的,其中實(shí)驗(yàn)組含有232個(gè),對照組含有88個(gè)。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明其中32個(gè)突變具有顯著性差異。這32個(gè)突變分布于mtDNA的D-loop區(qū)(4/32)、編碼區(qū)的RNR2(1/32)、COX1 (8/32)、 COX2 (3/32)、ATP6 (1/32)、COX3 (4/32)、ND4 (3/32)、ND5 (4/32)和CYTB(2/32)。對這些突變位點(diǎn)的相對風(fēng)險(xiǎn)性分析發(fā)現(xiàn),27個(gè)突變的OR值小于1,即為保護(hù)因素,可降低乳腺癌發(fā)病的機(jī)率。而另外5個(gè),即位于編碼區(qū)RNR2的2463位上的indelA、位于COX1的6296位上的CA、6298位上的indelT、位于ATP6的8860位上的AG和位于ND5的13327位上的indelA,這些位點(diǎn)的OR值大于1,分別為8.050、4.464、4.464、5.254、4.853,即表明這些突變可能提高乳腺癌發(fā)病的機(jī)率,為高風(fēng)險(xiǎn)因素。MT-RNR2是線粒體編碼的16srRNA,隸屬于Mt-rRNA家族,參與線粒體獨(dú)立的核糖體組裝。2463A位點(diǎn)的缺失可能使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,影響其與其他蛋白或核酸的結(jié)合。作為線粒體獨(dú)立轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)中重要的部件,其功能的喪失將直接影響到其他蛋白質(zhì)的合成,使整個(gè)線粒體的功能受到極大的影響。MT-COX1是在線粒體中合成的細(xì)胞色素c氧化酶中的1個(gè)亞基,是具有催化功能的重要單元。雖然COX1上的C6296T是一個(gè)無義突變,但是在研究中我們卻發(fā)現(xiàn)COX1上的C6296T點(diǎn)突變和6298T位點(diǎn)缺失突變總是同時(shí)出現(xiàn),其中的原因未知,而6298T的缺失突變卻可能造成編碼區(qū)的移碼突變,從而改變整條肽鏈的氨基酸序列。COX1作為細(xì)胞色素c氧化酶上重要的催化功能亞基,它的結(jié)構(gòu)改變將直接導(dǎo)致細(xì)胞色素c氧化酶催化功能的喪失。MT-ATP6編碼“生物分子馬達(dá)"ATP合成酶的一個(gè)亞基。在MT-ATP6編碼區(qū)的點(diǎn)突變A8860G使原來的極性氨基酸蘇氨酸(ACA)突變成非極性的丙氨酸(GCA),這必然會(huì)引起蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變,從而影響ATP合成酶的催化活性。MT-ND5編碼NADH脫氫酶(復(fù)合物Ⅰ)中的第五個(gè)亞基。13237A位點(diǎn)的缺失將使編碼區(qū)發(fā)生移碼突變,整條多肽鏈的氨基酸序列都將發(fā)生錯(cuò)義突變,因此蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而影響NADH脫氫酶復(fù)合物的功能。上述5個(gè)mtDNA突變均可能影響呼吸鏈的合成,通過nDNA與mtDNA基因相互調(diào)控,也將使核基因突變幾率增大以及引起細(xì)胞凋亡紊亂,對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展可能起著十分重要的作用。與以往的研究不同,本課題主要針對mtDNA的種系突變與乳腺癌的關(guān)系進(jìn)行研究,分析結(jié)果得到的5個(gè)突變有可能作為乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)人群評估的指標(biāo)之一,以達(dá)到早期預(yù)防的效果。而樣本采用外周血,其研究成果在將來也可以直接應(yīng)用于無創(chuàng)診斷技術(shù)當(dāng)中。由于時(shí)間的限制,本研究只采集了255例的樣本,而mtDNA的高通量測序在國內(nèi)尚未見報(bào)道,通過本課題已建立起較完善的技術(shù)流程,但在摸索過程中,部分樣本的測序質(zhì)量不太理想,為了保證關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果的科學(xué)性和可靠性,將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選,最終只得到了22例對照組和83例乳腺癌病例組的mtDNA數(shù)據(jù)用于關(guān)聯(lián)性分析。今后的研究將進(jìn)一步擴(kuò)大范圍,采集全國各地的樣本用于mtDNA全基因組關(guān)聯(lián)性分析。本研究中篩選得到的5個(gè)突變也將在更大規(guī)模的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

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率低于８０％、覆蓋深度低于１００Ｘ或覆蓋度不均一的樣本數(shù)據(jù)，最終篩選得到??對照組２２例和病例組８３例有效數(shù)據(jù)，樣品的數(shù)據(jù)量足夠可Ｗ將基因組的位點(diǎn)??全覆蓋（見圖９Ａ），平均覆蓋深度達(dá)到３００Ｘ?Ｗ上（見圖犯），這些數(shù)據(jù)將用??于突變位點(diǎn)與現(xiàn)腺癌疾病的關(guān)聯(lián)性分析。??■?ＣＯＶ：?Ｂ１?林Ｌ３００＊＂ｆｒＳ＂－Ｍ１??２５００－１?１?１?１?１?１?１?１?１—??田?２０００?Ｈ?Ｊ?１??ｒ??Ｉ?ｉ畫面云因面面圃??０?２０００?４０００?６０００?８０００?１００００?１２０００?１４０００?１６０００??Ｐｏｓ也ｏｎ?（ｎｔ）??Ａ??。５００?Ｉ?＇?＇￣￣＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇?＇??咖Ｍ咖ｉｌｉｉｌ??１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?巧化１７１８?巧?２０??ｓａｍｐｌｅ?＃??Ｂ??圖９部分樣品線粒體基內(nèi)組薇蓋度（Ａ）和平均禮蓋深度統(tǒng)計(jì)圖巧）??Ｆｉｇｕｒｅ?９?Ｃｏｖｅｒａｇｅ?（Ａ）?ａｎｄ?Ａｖｅｒａｇｅ?Ｃｏｖｅｒａｇｅ?Ｄｅｐ比（Ｂ）?ｏｆ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?Ｇｅｎｏｍｅ??６５??

．－５０ｎｇ心Ｌ，?５０ｕｌ，符合文庫構(gòu)建模板濃度要求。１％瓊脂糖凝膠電泳，１２０Ｖ，?３０ｍｉｎ。??在７２８７ｂｐ和９３９化Ｐ處有目的亮條帶，符合預(yù)期要求，表明ｍｔＤＮＡ捕獲成功（見??圖?４、?５）。??

本文編號：2852241