目的探究SIRT2基因?qū)θ思毙詥魏思?xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、凋亡的影響,以及可能的分子機(jī)制,為尋求新的治療靶向位點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法將體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞分為2組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組依據(jù)BML266的不同濃度可分為5個(gè)亞組2UM、3UM、4UM、5UM、6UM。(1)采用CCK-8法以及流式細(xì)胞術(shù)分別繪制各組細(xì)胞的生長曲線和檢測實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期。(2)應(yīng)用qRT-PCR法檢測實(shí)驗(yàn)組中“最佳濃度”細(xì)胞組中相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況:caspase3、caspase7、caspase9、Bcl2、Bax、p21、p53、cyclinD1、NF-κB、c-myc、G-CSFR、G-CSF。(3)應(yīng)用Western-blot法檢測實(shí)驗(yàn)組中“最佳濃度”細(xì)胞組中p21的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果(1)當(dāng)BML266濃度低于4UM時(shí),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組生長曲線無顯著差異。(2)BML266可抑制THP-1細(xì)胞增殖,當(dāng)給予4UM、5UM、6UM的BML266刺激THP-1細(xì)胞時(shí),G2-M/G0-G1期比例顯著下調(diào)(P0.05)。(3)當(dāng)給予4UM、5UM、6UM BML266刺激的THP-1細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P值均為0.05)。(4)給予4UM BML266刺激的THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組,G-CSFR的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。(5)予4UM BML266刺激的THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組,原癌基因NF-κB的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。(6)給予4UM BML266刺激的THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組,p21、p53及促凋亡基因Bax的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P值均0.05)。(7)給予4UM BML266刺激的THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組p21的蛋白質(zhì)水平升高(P值0.05)。(8)THP-1細(xì)胞在給予4UM BML266后,可抑制其生長、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但該濃度對(duì)HEK293T細(xì)胞的生長無明顯影響。結(jié)論(1)SIRT2特異性抑制劑BML266可能通過影響G-CSFR、NF-κB、p21、p53、Bax等基因的表達(dá),誘導(dǎo)G2-M/G0-G1期比例顯著下調(diào),抑制THP-1白血病細(xì)胞的增殖。(2)SIRT2可以通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路對(duì)THP-1白血病細(xì)胞的周期、凋亡進(jìn)行調(diào)控。(3)BML-266可抑制THP-1白血病細(xì)胞增殖,可能與p21蛋白的活化相關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R733.7
【部分圖文】：

IRT2 抑制劑對(duì) THP-1 白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制探索 2018 屆碩士學(xué).8.6 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)1) 引物混合物的配制：依次加入上游引物 10μl，下游引物 10μl，Rnawater 80μl，充分混勻；2) 反應(yīng)體系的配制：qPCR 反應(yīng)體系配制方案及 qPCR 反應(yīng)條件分別2-4 及圖 2-1，2-2，2-3：表 2-4 qPCR 反應(yīng)體系配制方案

圖 2-1：Bcl2、caspase9、G-CSF、G-CSFR、p21、p53 基因 qPCR 反應(yīng)條件Figure2-1: qPCR reaction conditions for Bcl2, caspase9, G-CSF, G-CSFR, p21 and p53 genes

圖 2-3：c-myc、cyclinD1 基因 qPCR 反應(yīng)條件Figure2-3: qPCR reaction conditions for c-myc, cyclinD1 genes2.8.7 實(shí)時(shí)定量 PCR 產(chǎn)物定量分析采用相對(duì)定量△△CT 法計(jì)算 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，按以下計(jì)算公式計(jì)算:a. 相對(duì)表達(dá)倍數(shù)=2—△△CTb. △CT=CT 靶基因—CT 內(nèi)參c. △△CT=△Ct 樣品—△Ct 校正品2.9 Western-blot 檢測靶基因蛋白質(zhì)的表達(dá)2.9.1 細(xì)胞總蛋白的提取(1) 加入 RIPA 裂解液、PMSF；(2) PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞 1 次，棄上清后加入 RIPA 裂解液 200ul，吹打數(shù)
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本文編號(hào)：2852135