乳腺癌是女性最普遍的惡性疾病。與世界其他大多數(shù)國家一樣,乳腺癌也是中國女性最常見的癌癥,2008年,中國乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全世界的12.2%和9.6%;而造成90%實體瘤病人死亡的根本原因是乳腺癌轉移。乳腺癌遠端轉移是一個極其復雜的過程,它涉及到原位瘤細胞浸潤并進入血液循環(huán)系統(tǒng),在新的微環(huán)境中產生轉移灶。然而乳腺癌是一種異質性的疾病,可以分為腔膜樣型、基底細胞樣型、HER2過表達型和正常乳腺樣型等4種亞型。乳腺癌異質性的特征也使得對乳腺癌轉移標準的評估產生了很大的風險,而且在治療上也非常困難。表皮-間質轉換(EMT)指的是在特定的生理或病理條件下,表皮樣細胞轉變?yōu)殚g質樣細胞的過程。主要表現(xiàn)為細胞表面粘附分子(如:E-cadherin)表達降低,細胞極性喪失,細胞骨架發(fā)生重塑,細胞的遷移和侵襲能力增強。EMT過程是胚胎發(fā)育中的一種正常生理活動,隨后也發(fā)現(xiàn)EMT在傷口愈合、炎癥反應、組織重建、腫瘤轉移等生物學過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞EMT發(fā)生導致細胞浸潤能力增強,因此EMT也被認為是腫瘤細胞轉移的起始步驟之一。在分子水平上,E-cadherin表達缺失是EMT發(fā)生的最重要標志事件。此外,很多轉錄因子,如Snail、Twist、ZEB1、ZEB2和FOXC2等均可以通過直接或間接的抑制E-cadherin啟動子的活性誘導EMT發(fā)生。近年來,越來越多的研究表明:表觀遺傳修飾參與E-cadherin的轉錄調控過程。組蛋白去乙�；窰DAC1/2、組蛋白去甲基化酶LSD1、組蛋白甲基轉移酶G9a和Suv39H1、以及DNA甲基轉移酶等都可以抑制E-cadherin基因的轉錄。表觀遺傳修飾調控的失調與腫瘤發(fā)生密切相關,在該領域的研究有助于揭示人類腫瘤發(fā)生和轉移的新機制。PRMT7屬于精氨酸甲基轉移酶家族的Ⅱ型成員,參與介導組蛋白或非組蛋白的對稱性二甲基化修飾。已有的研究表明,PRMT7可以參與男性印記基因甲基化、核糖體RNA的組裝、DNA損傷修復和細胞分化等多項生理活動。但是現(xiàn)在還沒有關于PRMT7參與腫瘤發(fā)生或轉移的報道。我們的免疫組化結果表明:PRMT7在乳腺癌組織中高水平表達;同時Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析也進一步證實了我們的結論。在細胞水平上,我們發(fā)現(xiàn)PRMT7在惡性乳腺癌細胞內高表達,而且過表達PRMT7可以誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT和轉移。在過表達PRMT7誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT過程中,E-cadherin等表皮markers表達下調;而N-cadherin等間質markers表達上調。進一步研究發(fā)現(xiàn),PRMT7能夠抑制表皮marker E-cadherin啟動子的轉錄活性,轉錄因子YY1能夠與PRMT7和HDAC3直接結合,并招募二者到E-cadherin啟動子上發(fā)揮轉錄抑制作用;在此過程中,PRMT7介導的H4R3me2s修飾水平在E-cadherin啟動子上增加,同時伴隨著H3K4me3、H3Ac和H4Ac修飾水平的減少。相反,降低PRMT7表達后,E-cadherin水平有所恢復,這主要是因為E-cadherin啟動子上H4R3me2s修飾減少,而H3K4me3和H4Ac修飾增加。我們的研究表明精氨酸甲基轉移酶PRMT7是乳腺癌發(fā)生轉移的一個重要誘導因子,同時我們也揭示了乳腺癌細胞發(fā)生EMT和轉移的一種新的表觀遺傳調控機制。該研究成果為開發(fā)靶向PRMT7治療轉移性乳腺癌提供了重要理論基礎。
【學位單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R737.9
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一部分 研究背景
    一、表皮-間質轉換與腫瘤轉移的關系
        （一） 表皮-間質轉換
        （二） 腫瘤細胞轉移
        （三） EMT與乳腺癌轉移的關系
    二、EMT的表觀遺傳調控機制
        （一） EMT與DNA甲基化
        （二） EMT與組蛋白修飾
        （三） EMT與非組蛋白修飾
        （四） EMT與miRNAs介導的翻譯后修飾
    三、人PRMT7 研究進展
        （一） PRMTs家族簡介
        （二） PRMT7 的功能與作用機制
    四、轉錄因子YY1 和去乙酰化酶HDAC3 的研究進展
        （一） YY1 的發(fā)現(xiàn)
        （二） YY1 的功能
        （三）HDAC3 的研究概述
    五、本論文研究內容及意義
        （一） 立題依據(jù)
        （二） 研究內容及意義
第二部分 實驗材料與方法
    一、實驗材料
        （一） 實驗儀器
        （二） 試劑
        （三） 抗體
        （四） 質粒
        （五） 細胞系
    二、實驗方法
        Ⅰ、分子生物學實驗方法
            （一） 表達質粒構建
            （二） 干涉質粒構建
            （三） 質粒提取方法
            （四） RNA提取、逆轉錄和Real-time PCR
            （五） 免疫印跡（Western Blot）
            （六） 免疫共沉淀實驗（CoIP）
            （七）染色質免疫共沉淀實驗（ChIP）
            （八） ChIP-re- ChIP實驗
            （九）蛋白純化及GST pull down實驗
            （十） 免疫熒光實驗（IF）
        Ⅱ、細胞生物學實驗方法
            （一） 細胞培養(yǎng)
            （二） 細胞瞬時轉染
            （三） 慢病毒的包裝及侵染
            （四）報告基因檢測
            （五）細胞遷移和侵襲實驗
            （六）細胞劃痕實驗
            （七）明膠酶譜實驗
            （八） MTT細胞活力檢測
        Ⅲ、臨床病理及活體實驗
            （一）免疫組化實驗（IHC）
            （二） 蘇木精-伊紅染色（HE）
            （三）裸鼠成瘤實驗
            （四）裸鼠轉移實驗
        Ⅳ、統(tǒng)計分析
第三部分 實驗結果與分析
    一、PRMT7 的表達與乳腺癌惡性程度正相關
        （一） PRMT7 在高轉移的乳腺癌細胞內高表達
        （二） PRMT7 在乳腺癌組織中表達高于癌旁組織
    二、PRMT7 異常表達誘導EMT發(fā)生
        （一） PRMT7 過表達誘導乳腺表皮細胞發(fā)生EMT
        （二）PRMT7 過表達誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT
        （三）降低PRMT7 表達部分逆轉EMT發(fā)生
    三、PRMT7 促進細胞遷移和侵襲
        （一） PRMT7 過表達增強細胞的遷移和侵襲能力
        （二）降低PRMT7 表達抑制細胞的遷移和侵襲
    四、PRMT7 介導的EMT進程中，E-cadherin啟動子上表觀遺傳修飾的變化
        （一） PRMT7 抑制E-cadherin啟動子的活性
        （二） E-cadherin啟動子上H4R3me2s修飾水平增加伴隨著H3K4me3 減少
        （三） H4R3me2s與組蛋白乙酰化修飾之間存在crosstalk
    五、YY1 招募PRMT7/HDAC3 復合物抑制E-cadherin的轉錄
        （一） PRMT7 與YY1 和HDAC3 存在于同一復合物中
        （二） YY1 與HDAC3 直接結合
        （三） YY1 招募PRMT7/HDAC3 到E-cadherin啟動子進行轉錄抑制
    六、PRMT7 促進乳腺癌的遠端轉移
        （一） PRMT7 促進乳腺癌細胞的轉移
        （二） PRMT7 抑制乳腺癌原位瘤的生長
第四部分 討論
    一、PRMT7 與腫瘤轉移
    二、表觀修飾與EMT
    三、YY1-PRMT7-HDAC3 三元復合物
    四、EMT與腫瘤細胞干性
主要結論和創(chuàng)新點
    一、主要結論
    二、創(chuàng)新點
參考文獻
附錄一
附錄二
附錄三
致謝
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