研究背景及目的膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中威脅人類健康最常見的惡性腫瘤,肌層浸潤性膀胱癌危害尤甚。膀胱癌治療后的高復(fù)發(fā)率及其惡性進(jìn)展的可能與腫瘤微環(huán)境(TME)中缺乏腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)以及腫瘤細(xì)胞通過免疫逃逸機(jī)制逃避了免疫細(xì)胞的殺傷密切相關(guān)。腫瘤疫苗是通過多種方式將腫瘤抗原接種至宿主體內(nèi)以獲得主動(dòng)免疫反應(yīng),從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。前期研究中,我們利用細(xì)胞膜表面易被生物素化以及生物素與鏈親和素(Streptavidin,SA)天然強(qiáng)有力結(jié)合的特性,成功地將帶有SA的細(xì)胞因子錨定于腫瘤細(xì)胞表面而制備成了一種新型腫瘤細(xì)胞疫苗。前期研究結(jié)果證實(shí)該疫苗能有效激活T細(xì)胞,但始終存在一部分小鼠的腫瘤消退不明顯。程序性死亡因子1受體/配體(PD-I/PD-L1)是體內(nèi)重要的協(xié)同刺激分子,已被證實(shí)可通過抑制T細(xì)胞的活化和增殖而負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏附蛋白-3(Tim-3)是Tim家族成員之一,當(dāng)與其天然配體半乳糖凝集素-9結(jié)合可引發(fā)輔助性T細(xì)胞功能下降,從而負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體的抗腫瘤能力。結(jié)合我們前期研究工作和現(xiàn)有研究進(jìn)展,本實(shí)驗(yàn)擬探究SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗治療后小鼠TME中是否發(fā)生與PD-1、Tim-3表達(dá)相關(guān)的免疫逃逸;研究PD-1和Tim-3的表達(dá)對CD8-TILs功能的影響;評估PD-1、Tim-3序貫靶向阻斷聯(lián)合疫苗對晚期膀胱腫瘤的治療效果,并探討相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制。研究方法利用蛋白修飾細(xì)胞表面的技術(shù)制備SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗。通過對腫瘤大小的觀察比較,以及CTL、流式分析、免疫組化、ELISA等檢測方法,評估疫苗或疫苗聯(lián)合靶向共刺激分子阻斷治療轉(zhuǎn)移性膀胱腫瘤的效果以及探究相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制。研究結(jié)果1.通過已成瘤的小鼠皮下模型證實(shí)SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗能夠通過誘導(dǎo)脾臟中DCs的成熟激活CD8+TILs,但無法明顯抑制皮下已成瘤的腫瘤生長。2.該疫苗能夠上調(diào)CD8+TILs表面PD-1和Tim-3的表達(dá),同時(shí)也能以IFNy依賴的形式上調(diào)TME中PD-L1的表達(dá)。3.該疫苗聯(lián)合抗PD-1抗體較單獨(dú)治療能夠明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長,但總體應(yīng)答率較低(12.5%)。4.PD-1靶向阻斷能夠上調(diào)CD8+TILs表面Tim-3的表達(dá)。5.PD-1+Tim-3+CD8+TILs的增殖和分泌能力明顯低于其他亞型,PD-1lTim-3+CD8+TILs的分泌能力較低,但具備良好的增殖能力。6.抗PD-1抗體和抗Tim-3抗體序貫靶向阻斷聯(lián)合新型疫苗能有效增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷,降低促腫瘤生長的progranulin和IL-6的分泌,減少CD8+TILs的凋亡,從而有效抑制小鼠皮下腫瘤的生長,提高治療的應(yīng)答率(45.8%)。研究結(jié)論抗PD-1抗體和抗Tim-3抗體序貫靶向阻斷聯(lián)合SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗能夠有效抑制晚期膀胱腫瘤的生長。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

流式細(xì)胞儀檢測膜修飾的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗表面ＧＭ－Ｃ純生物素化未結(jié)合細(xì)胞因子的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞作為對照－１?Ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｆ?ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｏｆ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ?（ｕｎｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｓｅｒｖｅ?ａｓ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ飾的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ生物活實(shí)驗(yàn)方法，將己制備好的ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ膜修飾的ＭＢ４９片懸液按不同濃度梯度加置９６孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加，利用ＭＴＴ法檢測小鼠骨髓細(xì)胞的增殖情況。利用數(shù)據(jù)進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析。結(jié)果表明：Ｆ涵＝３０１．６１４，?Ｐ?濃度＜０．０１；?Ｆ?組間Ｘ濃度＝?２１．５６５，?Ｐ＜０．０１。結(jié)果顯示膜疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ具備良好的促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞

０?１０２?１０３?１〇４?ｔｏ５??ＰＥ??圖２－１流式細(xì)胞儀檢測膜修飾的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗表面ＧＭ－ＣＳＦ的錨定率（單??純生物素化未結(jié)合細(xì)胞因子的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞作為對照組）??Ｆｉｇ?２－１?Ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｆ?ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｏｆ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ａｓｓａｙｅｄ?ｂｙ?ｆｌｏｗ??ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ?（ｕｎｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｓｅｒｖｅ?ａｓ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ）??２．２．２膜修飾的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ生物活性檢測??按前述實(shí)驗(yàn)方法，將己制備好的ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ膜修飾的ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞??疫苗細(xì)胞碎片懸液按不同濃度梯度加置９６孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入小鼠骨髓細(xì)胞??懸液共孵育，利用ＭＴＴ法檢測小鼠骨髓細(xì)胞的增殖情況。利用ＳＰＳＳ１９．０統(tǒng)計(jì)??分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析。結(jié)果表明：Ｆ涵＝３０１．６１５，?Ｐｍ＜０．０１；??Ｆ?濃度＝３４．１７４，?Ｐ?濃度＜０．０１；?Ｆ?組間Ｘ濃度＝?２１．５６５，?Ｐ＜０．０１。結(jié)果顯示膜修飾的ＭＢ４９膀??胱腫瘤細(xì)胞疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ具備良好的促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞增殖的能力，說??明錨定于ＭＢ４９膀胱腫瘤細(xì)胞膜表面的ＧＭ－ＣＳＦ能夠保持良好的生物學(xué)活性（圖??２－２，表?２－１）〇??１０??

具為游標(biāo)卡尺，腫瘤體積的計(jì)算公式為：Ｖ＝ｋ／６?（ａｘｂ）?３／２?（Ｖ代表腫瘤體積，ａ??代表腫瘤長徑，ｂ代表腫瘤短徑）。利用統(tǒng)計(jì)軟件ＳＰＳＳ?１９．０重復(fù)測量方差分析對??數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖３－１，表３－１）：?Ｆ賴＝９５．３０９，?Ｐ＜０．０１，?Ｆ?＿＝２９１３．５７５，??Ｐ＜０．０１，時(shí)間和腫瘤體積有交互作用，ＦＭｘＷｆｉ］＝?６７．６５７，?Ｐ＜０．０１，說明各個(gè)組的??小鼠皮下腫瘤體積差異明顯，且各個(gè)組小鼠皮下腫瘤體積的差別在不同時(shí)間點(diǎn)??不一致，因此進(jìn)一步對每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤大小分別比較，采用單因素方差分析??（Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ），結(jié)果顯示：除第８天外，其余時(shí)間點(diǎn)ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ膜修飾??的膀胱癌腫瘤細(xì)胞疫苗組小鼠皮下腫瘤體積明顯小于其他組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??２１??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jennifer Kleponis;Richard Skelton;Lei Zheng;;Fueling the engine and releasing the break: combinational therapy of cancer vaccines and immune checkpoint inhibitors[J];Cancer Biology & Medicine;2015年03期

本文編號：2850510