背景:髓母細(xì)胞瘤是兒童期高發(fā)的腦部惡性腫瘤之一,占兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的15～30%。它起源于小腦蚓部或后髓帆,發(fā)生部位多處在小腦的第四腦室上部及小腦蚓部。目前髓母細(xì)胞瘤的治療主要包括手術(shù)的完整切除,輔以術(shù)后腦部和脊髓的放療和化療。手術(shù)是髓母細(xì)胞瘤非常重要的治療手段,可以減輕腦積水,降低顱壓,明確病理診斷。然而手術(shù)治療常不能根治髓母細(xì)胞瘤,因此髓母細(xì)胞瘤患者術(shù)后常結(jié)合放療或化療治療。放療是根據(jù)患者病情不同在術(shù)后給予不同程度的放射治療,可輔助提高患者的生存率和降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。然而放療有可能給患者帶來中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遠(yuǎn)期毒副反應(yīng),如聽力損傷、認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)智力發(fā)育遲緩等。因此研究者希望能通過聯(lián)合使用化療方法進(jìn)行輔助治療。髓母細(xì)胞瘤的化療藥物主要包括環(huán)磷酞胺、長春新堿、卡鉑、甲氨蝶呤和依托泊苷等。由于化學(xué)合成藥物常常具有一定的副作用,近年來天然植物提取物以其副作用較少的優(yōu)勢(shì)在腫瘤治療中的應(yīng)用日益受到關(guān)注,成為腫瘤包括髓母細(xì)胞瘤治療藥物篩選的熱點(diǎn)方向。因此,篩選新的有效的治療藥物,對(duì)髓母細(xì)胞瘤獲得良好預(yù)后具有重要的意義。天然植物提取物在腫瘤治療中具有重要的意義,因此,越來越多的研究致力于尋找新的更優(yōu)的可治療腫瘤的天然植物提取物。淫羊藿苷是小蘗科植物淫羊奮的提取物,又稱仙靈脾,味辛、甘,性溫,歸肝、腎兩經(jīng),具有補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕的功效�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明淫羊藿苷作為淫羊霍的主要活性成份,具有的補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤等藥理作用,是目前多種藥物的重要成分,包括抗抑郁類藥物、神經(jīng)保護(hù)類藥物和免疫調(diào)節(jié)類藥物等。目前已有研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞凋亡和周期阻滯、降低細(xì)胞侵襲遷移能力等,從而在多種人類腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。然而淫羊藿苷在不同類型腫瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制不盡相同,而且淫羊藿苷在髓母細(xì)胞瘤中是否發(fā)揮重要作用尚不清楚。基于以上背景,我們對(duì)淫羊蕾苷在髓母細(xì)胞瘤中的作用及其分子機(jī)制展開研究。目的:1、檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響。2、檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響。3、檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。4、檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。5、檢測(cè)淫羊蕾苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。6、檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞成瘤能力的影響。方法:1、將生長狀態(tài)良好的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,按照1×106/孔的密度接種到96孔板中,每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔,采用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷處理對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力的影響。2、取生長狀態(tài)良好的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,接種到6孔板,每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔,調(diào)整細(xì)胞密度為100個(gè)/孔,用結(jié)晶紫染色液對(duì)形成的細(xì)胞克隆染色,并在光鏡下觀察不同濃度淫羊藿苷處理對(duì)Daoy和D341細(xì)胞克隆形成能力的影響。3、取對(duì)數(shù)生長期的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,用預(yù)冷70%乙醇處理細(xì)胞,加PI試劑,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的淫羊藿苷對(duì)Daoy和D341細(xì)胞周期的影響;取對(duì)數(shù)生長期的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,收集并定量蛋白,采用western blot方法檢測(cè)不同濃度的淫羊蕾苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。4、取對(duì)數(shù)生長期的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的淫羊藿昔對(duì)Daoy和D341細(xì)胞凋亡的影響;取對(duì)數(shù)生長期的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341,收集并定量蛋白,采用western blot方法檢測(cè)不同濃度的淫羊藿苷對(duì)Daoy和D341細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。5、構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,在動(dòng)物水平檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞成瘤能力的影響;采用免疫熒光法檢測(cè)淫羊藿昔對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響;采用western blot方法檢測(cè)淫羊蕾苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響。結(jié)果:1、淫羊藿苷可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341的細(xì)胞生長,并且具有劑量和處理時(shí)間依賴性。2、淫羊藿苷可明顯抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341的細(xì)胞克隆形成能力,且具有劑量依賴性,淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341形成的克隆數(shù)量明顯較少,且克隆直徑明顯較小。 _3、淫羊藿苷可引起髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341的細(xì)胞周期S期阻滯:淫羊藿苷處理組S期細(xì)胞比例明顯較高,而G0期和G2期細(xì)胞比例則明顯較少;淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表達(dá)水平明顯降低。4、淫羊藿苷可誘導(dǎo)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341的細(xì)胞凋亡,且具有劑量依賴性,淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341出現(xiàn)較多的細(xì)胞濃縮、細(xì)胞核斷裂等特征。此外,淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy和D341早期和晚期凋亡的細(xì)胞比例明顯升高。免疫印跡顯示淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy 和 D341 細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白 Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP蛋白水平的表達(dá)明顯上升,而抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)明顯下降。5、淫羊藿苷可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞體內(nèi)移植瘤生長,且呈現(xiàn)劑量依賴性。淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞體內(nèi)移植瘤組織中增殖標(biāo)志PCNA表達(dá)明顯下降,而凋亡標(biāo)志cleaved-caspase-3表達(dá)顯著上升。與之一致的是,淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞移植瘤組織中促凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP蛋白水平的表達(dá)明顯上升,而抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)明顯下降。結(jié)論:1、淫羊蕾苷可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力。2、淫羊蕾昔可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力。3、淫羊藿苷可誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯;淫羊蕾苷通過抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯。4、淫羊藿苷可引起細(xì)胞凋亡;淫羊藿苷通過上調(diào)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白 Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP 的表達(dá),抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5、淫羊蕾苷可以抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

用ＣＣＫ－８方法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，淫羊藿苷對(duì)兩種髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ??和Ｄ３４１的增殖活力均有明顯的抑制作用，并且淫羊蕾苷對(duì)兩種髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞??的抑制作用都是劑量依賴的（圖１－１Ａ）。另外，我們采用１０ｐＭ的淫羊藿苷處理??髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１，分別于２４小時(shí)、４８小時(shí)和７２小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞??活力。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長，淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和??Ｄ３４１的抑制作用也隨之增強(qiáng)，７２小時(shí)后，淫羊藿苷對(duì)兩種髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力??的抑制作用均達(dá)到５０％?（圖１－１Ｂ）。這些結(jié)果表明，淫羊藿苷可抑制髓母細(xì)胞瘤??細(xì)胞活力，且這種抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴性。??Ａ?Ｂ??４８ｈ?ｌ〇ｎＭ?口?Ｄａｏｙ??１５〇ｉ?Ｄａｏｙ?１００１?＿?Ｄ３４１??ｇ?－ｍ－?Ｄ３４１?ｇ?８０－?ｊｒ??ｉｉ〇〇＾ｘ?ｉ６〇?ｎ?ｘ?Ｉ．??！?！４０－?ｆｉ?ｌｉｉ??Ｅ?Ｓ２〇－?ＩＩＩ??〇－ｌ???１???？???１???１???１?０－＾—＾？￣￣＾￣＾—??０?１０?２０?３０?４０?５０?１?２?３?１?２?３??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（＾Ｗ）?Ｔｉｍｅ?ａｆｔｅｒ?ｐａｓｓａｇｅ?（ｄａｙｓ）??圖１淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１活力的影響。Ａ．不同濃度淫羊藿苷對(duì)髓母??細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１活力的影響；Ｂ．淫羊藿苷處理不同時(shí)間對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ??和Ｄ３４１活力的影響。＊：與處理１天時(shí)比較

為了驗(yàn)證淫羊藿苷對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響，我們使用０，?５，??１０和２（ＶＭ的淫羊藿苷處理髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１。結(jié)果顯示，淫羊藿??苷處理可以明顯抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ（圖２－２Ａ，２Ｃ，２Ｄ）和Ｄ３４Ｋ圖２－２Ｂ，??２４??

測(cè)結(jié)果顯示，淫羊藿苷處理后的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１細(xì)胞更多的集中??在Ｓ期，而Ｇ１期的細(xì)胞相應(yīng)較少，且隨著淫羊藿苷處理濃度的升高，Ｓ期阻滯??程度越高（圖３Ａ，?３Ｂ），而且這種抑制作用隨著淫羊藿苷處理濃度的提高而增??強(qiáng)。此外，我們對(duì)不同濃度淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１中細(xì)??胞周期蛋白Ａ、Ｂ１和細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶ＣＤＫ２的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)??現(xiàn)，淫羊藿苷處理的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１中ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｙｃｌｉｎＢｌ和ＣＤＫ２??的表達(dá)水平均明顯受到抑制（圖３Ｃ）。這些結(jié)果顯示，淫羊藿苷能夠引起髓母細(xì)??胞瘤細(xì)胞周期阻滯，從而起到抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的作用。??２５??
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本文編號(hào)：2849807