目的:明確NPRL2在前列腺癌中的表達情況以及其對前列腺癌DU145和PC3細胞體外增殖影響;進一步探究干擾NPRL2表達后對前列腺癌細胞DU145和PC3體外凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制;深入探討干擾NPRL2表達后對前列腺癌細胞DU145和PC3體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制的探討。方法:一體外實驗:1.體外凋亡檢測:1)使用RT-PCR和Western Blot檢測人正常前列腺細胞株RWEP-1和前列腺癌DU145和PC3細胞株中NPRL2的表達量;2)對前列腺癌PC3和DU145細胞株進行慢病毒NPRL2 sh RNA轉(zhuǎn)染,首先,通過熒光法確定轉(zhuǎn)染成功,然后對轉(zhuǎn)染后的DU145和PC3細胞株分別從mRNA及protein水平對NPRL2的表達量進行檢測;3)對轉(zhuǎn)染后的DU145和PC3細胞株進行增殖能力檢測使用CCK-8法;4)運用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染后的DU145和PC3進行凋亡和周期的檢測;5)運用Hoechst染色對轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡進行細胞形態(tài)學(xué)上的檢測6)使用RT-PCR和Western Blot對轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡蛋白進行檢測;7)使用劃痕和Transwell對轉(zhuǎn)染后細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力進行檢測;8)使用Western Blot及RT–q PCR對NPRL2及其調(diào)控的下游PI3K/AKT/GSK-3β信號通路進行檢測;2.體外侵襲轉(zhuǎn)移的檢測:1)運用Transwell和劃痕對前列腺癌DU145和PC3細胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移進行檢測;2)使用Western Blot及RT–qPCR對NPRL2及其下游的NF-κB/MMP-9信號通路進行檢測。二體內(nèi)實驗:體內(nèi)實驗:檢測轉(zhuǎn)染后細胞在體內(nèi)的成瘤率,及成瘤后腫瘤縮減率;使用HE染色觀察瘤體中腫瘤細胞的形態(tài)變化;使用免疫熒光檢測瘤體中凋亡相關(guān)蛋白的變化;使用免疫組化法對瘤體中凋亡相關(guān)蛋白表達進行檢測;使用Western blot及RT-PCR對NPRL2及凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白和基因進行檢測。三數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)分析:采用SPSS 18.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.與正常的前列腺細胞系RWPE–1相比,NPRL2在前列腺癌細胞系DU145和PC3中的表達量明顯上升;2.干擾NPRL2表達后,人前列腺癌細胞DU145和PC3的體外增殖能力明顯下降;3.干擾NPRL2表達后,可以有效抑制人前列腺癌細胞DU145和PC3的凋亡和周期;4.干擾NPRL2表達后,可以有效抑制人前列腺癌細胞DU145和PC3的凋亡信號通路PI3K/AKT/GSK-3β的表達;5.干擾NPRL2表達后,可以有效抑制可以有效抑制人前列腺癌細胞DU145和PC3的體外侵襲轉(zhuǎn)移,并對相關(guān)通路NF-κB/MMP-9產(chǎn)生影響;6.體內(nèi)實驗證實,干擾NPRL2表達后,可以有效抑制裸鼠體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)論:NPRL2在前列腺癌細胞DU145和PC3中高表達,干擾NPRL2的表達可以有效降低前列腺癌細胞DU145和PC3的體外增殖,并可以抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移,體內(nèi)實驗證實干擾NPRL2的表達可以有效抑制前列腺癌細胞DU145和PC3體內(nèi)的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

圖1-1. RWPE-1和DU145，PC3中NPRL2蛋白和基因水平的變化。注：*P＜0.05 與對照組比較Figure 1-1. The level change of NPRL2 proteins and genes in DU145，PC3 andRWPE-1 cellsNote:*P＜0.05 vs control group2.2 NPRL2 慢病毒轉(zhuǎn)染后陽性克隆的篩選我們采用 NPRL2 特異性 shRNA 慢病毒及 Mock 空載對照慢病毒對 DU145 和PC3 細胞進行轉(zhuǎn)染，然后使用嘌呤霉素進行篩選并挑選出單克隆細胞。然后使用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后的 NPRL2-DU145、Mock-DU145、NPRL2-PC3、Mock-PC3和 PC3 五組細胞進行觀察。結(jié)果顯示，NPRL2-DU145、Mock-DU145、NPRL2-PC3及 Mock-PC3 均可見綠色熒光，而 PC3 組不可見綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功（圖 1.2）。

圖 1.4 FCM 檢測細胞凋亡Fig.1.4 Cell apoptosis were detected by FCM2.7 FCM 檢測過表達 NPRL2 對細胞周期的影響我們通過流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染過 NPRL2 的 NPRL2-DU145、Mock-DU145 和 PC3組細胞及 NPRL2-PC3、Mock-PC3 和 PC3 組細胞進行檢測。FCM 結(jié)果顯示，NPRL2-DU145 組細胞的細胞周期大多在 G0/G1 期，部分在 S 期，對比對照組，過表達 NPRL2 可以有效的將細胞周期阻滯在 G0/G1 期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明在前列腺癌細胞中低表達 NPRL2 可以有效抑制細胞周期（表 1.3 圖 1.5）。表 1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期Name G0/G1(%) S(%) G2/M

圖 1.5 FCM 檢測細胞周期Fig.1.5 Cell cycle were detected by FCMoechst 染色檢測轉(zhuǎn)染 NPRL2 后對各組細胞凋亡的形態(tài)學(xué)影了檢測過表達 NPRL2 對細胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響，我們使用 Hoechst 染色-DU145、Mock-DU145 和 PC3 組細胞及 NPRL2-PC3、Mock-PC3 和 PC行檢測。Hoechst 結(jié)果顯示，與 Mock-DU145 和 DU145 組細胞相比，低L2 的 NPRL2-DU145 組細胞，其細胞核皺縮和破碎程度更加劇烈；同時 也是這樣的趨勢，證明低表達 NPRL2 可以有效誘導(dǎo)細胞凋亡。（見圖
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本文編號：2849011