目的及內(nèi)容:腎癌又稱為腎腺癌或腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma,RCC),起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng),是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。腎癌的臨床癥狀不典型,約30%的患者在診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)展成轉(zhuǎn)移性腎癌。腎癌的治療較困難,盡管外科手術(shù)聯(lián)合免疫治療作為一種新興的治療手段,但它仍沒(méi)有達(dá)到滿意的治療效果。因此,深入研究RCC增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,探索新的轉(zhuǎn)移性腎癌治療靶點(diǎn)是RCC研究的至關(guān)重要任務(wù)。Ras-GTP酶激活蛋白Src同源結(jié)構(gòu)域3結(jié)合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein,G3BP1)在多種腫瘤中過(guò)表達(dá),包括乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和肝癌等,但其在腎癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將檢測(cè)G3BP1在RCC中的表達(dá)情況,及其表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性,探討G3BP1在體外和體內(nèi)對(duì)RCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,初步明確G3BP1在調(diào)控腎癌增殖和轉(zhuǎn)移中的相關(guān)分子機(jī)制。方法:1.應(yīng)用Western blot和免疫組化的方法檢測(cè)G3BP1在腎癌組織和其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析G3BP1表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。2.應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建G3BP1穩(wěn)定降表達(dá)的腎癌ACHN和A498細(xì)胞系,Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平。3.應(yīng)用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G3BP1降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN和A498增殖能力的影響。4.應(yīng)用Western blot檢測(cè)G3BP1降表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白c-myc、cyclin D1表達(dá)的影響。5.應(yīng)用遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)和EGF誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G3BP1降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN和A498遷移能力、侵襲能力和EGF誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響。6.應(yīng)用Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G3BP1降表達(dá)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。7.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選G3BP1降表達(dá)影響腎癌增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號(hào)通路分子。8.應(yīng)用Western blot檢測(cè)G3BP1在調(diào)控腎癌增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制。9.應(yīng)用Western blot檢測(cè)G3BP1、p-STAT3及IL-6在臨床腎癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析G3BP1的表達(dá)與p-STAT3及IL-6表達(dá)的相關(guān)性。10.應(yīng)用小鼠活體成像技術(shù)研究G3BP1降表達(dá)對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞原位異種移植瘤增殖和肝肺轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:1.Western blot和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與相對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比,G3BP1在腎癌組織中表達(dá)增高,且G3BP1表達(dá)與TNM分期和Fuhrman分級(jí)相關(guān)(*P0.05),而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位和腫瘤壞死等因素?zé)o關(guān)。2.應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成功建立G3BP1穩(wěn)定降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498系,Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)G3BP1的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平(**P0.01)均明顯下降。3.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比增殖能力均顯著降低(**P0.01)。4.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白c-myc和cyclin D1表達(dá)水平均明顯下降。5.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比,遷移能力、Matrigel侵襲能力和EGF誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)能力均顯著降低(**P0.01)。6.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)水平明顯升高,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin、Vimentin、Snail和Snail表達(dá)水平明顯減低。7.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比,p-STAT3信號(hào)通路的活性受到明顯抑制(**P0.01)。8.G3BP1降表達(dá)的腎癌細(xì)胞ACHN和A498與對(duì)照組相比,p-STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低;G3BP1降表達(dá)顯著抑制IL-6對(duì)下游信號(hào)分子STAT3的活化,從而抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(**P0.01);STAT3的特異性抑制劑stattic不影響G3BP1的表達(dá)。9.與相對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比,腎癌組織中G3BP1、IL-6和p-STAT3的表達(dá)均升高(*P0.05),且G3BP1的表達(dá)與IL-6和p-STAT3的表達(dá)顯著相關(guān)(**P0.01)。10.G3BP1降表達(dá)組與對(duì)照組相比,腎臟原位腫瘤部位和肝肺轉(zhuǎn)移灶部位的熒光強(qiáng)度降低,且腎臟原位腫瘤體積較小,形成的肝肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目也明顯比對(duì)照組少(**P0.01)。結(jié)論:1.G3BP1在腎癌組織中高表達(dá),且能夠促進(jìn)腎癌增殖和轉(zhuǎn)移。2.G3BP1降表達(dá)后,通過(guò)抑制c-myc和cyclin D1等細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞增殖。3.G3BP1降表達(dá)后,通過(guò)抑制EMT來(lái)抑制腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。4.G3BP1降表達(dá)后,p-STAT3信號(hào)通路的活性受到明顯抑制;G3BP1降表達(dá)能夠顯著抑制IL-6對(duì)下游信號(hào)分子STAT3的活化,從而抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.與相對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比,腎癌組織中G3BP1、IL-6和p-STAT3的表達(dá)均升高,且G3BP1的表達(dá)與IL-6和p-STAT3的表達(dá)顯著相關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：

結(jié)果1 G3BP1 在腎癌組織中高表達(dá)我們首先通過(guò) Western blot 檢測(cè) 16 對(duì) RCC 組織和其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中G3BP1 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，G3BP1 在 RCC 組織與癌旁組織相比表達(dá)增加（*P<0.05）（圖 1 A，1 B）。為了進(jìn)一步描述 G3BP1 的表達(dá)與 RCC 患者臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，我們收集了 43 例 RCC 患者，用 G3BP1 抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（圖 1 C）。與 Western blot 結(jié)果一致，G3BP1 在 RCC 樣本中高表達(dá)，表達(dá)率為 51.2%（22/43），而在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中 G3BP1 表達(dá)率僅為 25.6%（11/43），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0147，OR=3.048，95%CI 1.227-7.568）。進(jìn)一步分析顯示，在 RCC 患者中 G3BP1 的表達(dá)水平與 TNM 分期和 Fuhrman分級(jí)顯著相關(guān)（*P<0.05）（表 1）。與此同時(shí)，G3BP1 的表達(dá)與其他臨床病理特征，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤壞死等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表 1）。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，G3BP1 在 RCC 中高表達(dá)且其表達(dá)水平與 RCC 進(jìn)展有關(guān)。

圖 2 G3BP1 降表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。 A：左圖為用 Western blot 驗(yàn)證 G3BP1 降表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功，其中 β-actin 作為內(nèi)參；Naive 代表未轉(zhuǎn)染組；Scr 代表導(dǎo)入空質(zhì)粒Scr組；shG3BP1代表導(dǎo)入G3BP1降表達(dá)質(zhì)粒組；右圖為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)G3BP1的 mRNA 表達(dá)情況，其中 GAPDH 作為內(nèi)參；B：CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) G3BP1 降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的影響，其中橫坐標(biāo)代表時(shí)間；縱坐標(biāo)代表在 450nm 處的吸光度值；C：遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè) G3BP1 降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞遷移能力的影響，左圖為腎癌細(xì)胞穿過(guò) 8μm 濾膜的代表圖片（200×）；右圖為計(jì)數(shù)穿過(guò) 8μm 濾膜的腎癌細(xì)胞數(shù)，縱坐標(biāo)代表一個(gè)高倍鏡視野下的細(xì)胞數(shù)；D：侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) G3BP1 降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響，左圖為腎癌細(xì)胞穿過(guò)鋪上 Matrigel 膠的 8μm 濾膜的代表圖片（200×）；右圖為計(jì)數(shù)穿過(guò)鋪上 Matrigel 膠的 8μm濾膜的腎癌細(xì)胞數(shù)，縱坐標(biāo)代表一個(gè)高倍鏡視野下的細(xì)胞數(shù)；E：EGF 誘導(dǎo)的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè) G3BP1 降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞趨化能力的影響，左圖為腎癌細(xì)胞穿過(guò) 8μm 濾膜的代表圖片（200×）；右圖為計(jì)數(shù)穿過(guò) 8μm 濾膜的腎癌細(xì)胞數(shù)，縱坐標(biāo)代表一個(gè)高倍鏡視野下的細(xì)胞數(shù)；NS 代表 P>0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*代表 P<0.05；**代表 P<0.01。

34圖3 G3BP1降表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的表達(dá)。A：Westernblot 檢測(cè)腎癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；B：Western blot 檢測(cè)腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況；C：免疫熒光檢測(cè)腎癌 ACHN 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。4 G3BP1 降表達(dá)通過(guò)抑制 IL-6 對(duì) STAT3 的活化來(lái)抑制腎癌細(xì)胞遷移和侵襲為進(jìn)一步探索 G3BP1 調(diào)節(jié) RCC 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化潛在的分子機(jī)制，我們首先通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選 G3BP1 降表達(dá)后可能影響的信號(hào)通路，包括STAT3、AP1、ISRE、TGFβ（p3TP）、P53、NFAT 和 WNT（TOPFlash）。結(jié)果表明 G3BP1 降表達(dá)后，多種腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路活性受到抑制，包括STAT3、AP1 和干擾素（ISRE）信號(hào)通路等（圖 4 A）。在這些信號(hào)通路中我們
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本文編號(hào)：2848439