目的:探討(mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS))多功能栓塞微球的物化性能表征及CT成像、微波增敏、ZrO2@(DOX+ILS)釋放功能的體外實(shí)驗(yàn)研究方法:(1)空白mPEG-PLGA微球和mPEG-PLGA@ZrO2@(ILs+DOX)微球的形貌和粒徑通過光學(xué)顯微鏡(OM UB100i)和掃描電子顯微鏡(SEM,S-4300,Hitachi)觀察,用Nano Measurer(粒度分析軟件)測量100個(gè)微球的粒徑測定其粒度分布。SEME-EDS用來測定元素的種類和面分布。(2)取不同濃度(0,1.25mg/ml,2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)的溶液放入PE管內(nèi),利用西門子雙源CT進(jìn)行掃描,觀察不同濃度的CT值。(3)將30 mg mPEG-PLGA@ZrO2@(ILs+DOX)微球分散在1ml的生理鹽水中,與生理鹽水做對比,應(yīng)用功率為1.8 W的微波照射5 min,紅外熱成像儀實(shí)時(shí)監(jiān)測消融區(qū)域的溫度變化,統(tǒng)計(jì)消融中心區(qū)域及距離消融中心1cm區(qū)域的溫度。用明膠水凝膠模擬人體環(huán)境,將材料均勻的分散到水凝膠中(濃度5mg/m L),與無材料的明膠水凝膠做對比,用功率為4W微波照射2min,消融后統(tǒng)計(jì)水凝膠融化的面積。(4)ZrO2@(ILs+DOX)的釋放試驗(yàn)中,將濃度為3mg/m L的微球分別置于37℃和65℃下孵育10min,3000r/min下離心,SEM觀察離心的底物mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)的形狀,TEM觀察上清液中的ZrO2@(DOX+ILS)數(shù)量。結(jié)果:(1)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下,空白材料(mPEG-PLGA)呈規(guī)則的球形,且具有良好的分散性,尺寸分布在35-65μm之間,平均粒徑為43.1μm。mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的光學(xué)照片,掃描電鏡照片及粒度統(tǒng)計(jì),包覆ZrO2@(DOX+ILS)后并未影響材料的形貌極其分散性,平均粒徑變?yōu)?8.66μm,略有增加。SEM-EDS測試發(fā)現(xiàn),材料中含有的C,Zr,P,F,N分別來自mPEG-PLGA骨架,ZrO2,1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和阿霉素。(2)顯示含有mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的溶液密度隨著濃度的增加而亮度升高,CT值隨著濃度增加而升高,呈線性關(guān)系(3)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)溶液,與生理鹽水相比消融中心區(qū)域升溫效果(30±7.49℃,17±5.63℃),兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001),距離消融中心1cm處的升溫效果(18.51±7.64℃,6.91±1.91℃);材料組的消融面積比對照組提高了30.6%。(4)在37℃下,微球的形貌并未發(fā)生明顯變化,釋放后的上清液僅僅發(fā)現(xiàn)極少的ZrO2@(DOX+ILS),說明微球并未出現(xiàn)明顯熱感應(yīng),在65℃下,微球出現(xiàn)變形破裂的現(xiàn)象。透射電鏡下釋放后的上清液中出現(xiàn)了大量的ZrO2@(DOX+ILS)。結(jié)論:1、證明了ZrO2@(DOX+ILS)被成功包覆到mPEG-PLGA空白微球當(dāng)中。2、在體外的實(shí)驗(yàn)研究中,mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有CT成像功能;3、在體外的實(shí)驗(yàn)研究中,mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有微波增敏功能;4、在體外的實(shí)驗(yàn)研究中,微波加速mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球中ZrO2@(DOX+ILS)顆粒及阿霉素釋放。目的:探討mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球在兔VX2肝腫瘤模型的血管栓塞和阿霉素緩釋功能。方法:(1)選取9只瘤兔,腫瘤大小直徑在1.2cm左右,隨機(jī)分成3組(1天,6天,9天),每組3只,經(jīng)肝動(dòng)脈注入mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球,術(shù)后1天,6天,9天各處死三只瘤兔,取腫瘤組織,心肺腎脾組織,進(jìn)行組織學(xué)檢測及冰凍切片。(2)動(dòng)脈血管的栓塞作用:肝動(dòng)脈注入多功能微球后利用DSA觀察正常兔肝動(dòng)脈栓塞情況;經(jīng)肝動(dòng)脈超選擇腫瘤供血?jiǎng)用}利用DSA觀察腫瘤染色;術(shù)后24小時(shí)利用CT掃描觀察腫瘤的留藥情況(3)冰凍切片及HE染色觀察腫瘤內(nèi)外阿霉素?zé)晒獾姆植?利用Image J軟件進(jìn)行半定量對比分析(4)冰凍切片觀察術(shù)后1天、6天、9天阿霉素在腫瘤組織內(nèi)熒光,并用Image J軟件進(jìn)行半定量分析(5)冰凍切片觀察術(shù)后1天、6天、9天阿霉素在心肺脾腎內(nèi)熒光及心肺脾腎組織的HE染色,利用Image J軟件進(jìn)行各組織熒光半定量分析。結(jié)果:(1)在DSA引導(dǎo)下,對正常兔經(jīng)肝動(dòng)脈注入一定量的mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球,造影顯示肝左右動(dòng)脈血管影消失;在對VX2肝腫瘤兔進(jìn)行mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球腫瘤血管栓塞的實(shí)驗(yàn)過程中,顯示腫瘤的供血血管部分被mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球栓塞,腫瘤區(qū)域濃聚,栓塞劑存留。栓塞24小時(shí)后,CT斷層掃描可見肝臟內(nèi)低密度的腫瘤區(qū)域呈現(xiàn)明顯的高密度。(2)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球治療后,使微球栓塞在腫瘤血管內(nèi),阿霉素能夠在瘤組織內(nèi)大量釋放,而周邊的正常的肝組織內(nèi)只有少量的阿霉素),應(yīng)用image J軟件進(jìn)行半定量分析,可見腫瘤內(nèi)的阿霉素顆粒明顯高于腫瘤外。HE染色顯示腫瘤組織內(nèi)可見大量的黑色顆粒(載阿霉素的二氧化鋯);(3)阿霉素光在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅光,1天腫瘤組織內(nèi)可見少量阿霉素?zé)晒?6天及9天可見大量阿霉素?zé)晒?利用Image軟件半定量分析顯示所示,6天腫瘤內(nèi)阿霉素的個(gè)數(shù)最多(4)術(shù)后1天脾臟內(nèi)可見少量阿霉素?zé)晒?心肺腎內(nèi)未見明顯的阿霉素?zé)晒?術(shù)后6天心肺脾腎內(nèi)可見少量阿霉素?zé)晒?術(shù)后9天,心肌內(nèi)未見阿霉素?zé)晒?肺脾腎內(nèi)可見少量阿霉素?zé)晒狻?5)治療1天6天9天后HE染色,肺脾腎心肌組織未見異常改變。結(jié)論:(1)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有血管栓塞的作用(2)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球經(jīng)肝動(dòng)脈超選擇注入腫瘤血管內(nèi),阿霉素主要存留在腫瘤組織內(nèi)(3)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有阿霉素緩釋的作用目的:探討肝動(dòng)脈注入阿霉素緩釋、微波增敏功能的多功能栓塞微球在VX2肝腫瘤模型中的治療作用。方法:選取24只瘤兔,腫瘤大小在1.0-1.5cm,隨機(jī)分成4組,每組6只,A組:空白組,不給予任何治療;B組:單獨(dú)給予微波消融;C組:經(jīng)肝動(dòng)脈給予mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球(栓塞組);D組:經(jīng)動(dòng)脈給予mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球合并微波消融(栓塞+消融組)。對微波組及微波+栓塞組瘤兔進(jìn)行微波消融(15w,2450f,2min),同時(shí)利用紅外成像儀實(shí)時(shí)記錄消融中心區(qū)域的溫度變化,利用軟件計(jì)算距離消融中心0.5cm區(qū)域的溫度變化。利用MR DWI序列比較消融后24小時(shí)的殘留體積大小。比較栓塞組及栓塞+微波組瘤兔24小時(shí)腫瘤組織進(jìn)行冰凍切片,利用熒光顯微鏡觀察的阿霉素?zé)晒?同時(shí)取24小時(shí)腫瘤組織,進(jìn)行生物電鏡檢查,觀察細(xì)胞的超微細(xì)結(jié)構(gòu)及ZrO2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布;對各組瘤兔術(shù)后3-6-9天自耳緣靜脈抽取靜脈血,化驗(yàn)肝腎功(AST,ALT,BUN,Cr)及血常規(guī)(WBC,RBC,HCT,HGB,MCV,MCH,MCHC,PLT),測量3-6-9天的瘤兔體重變化,評估多功能微球在活體內(nèi)的生物安全性。利用CT及MRI DWI序列測量術(shù)前及術(shù)后1-3-6-9天的腫瘤體積大小及殘留腫瘤的體積大小,進(jìn)行腫瘤療效的評估,利用HE染色,觀察各組腫瘤組織病理改變。結(jié)果:(1)D組與B組消融中心區(qū)域溫度達(dá)到60℃所需要的時(shí)間(5.4±0.89℃,10.4±1.14℃),兩組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。兩組的平均溫度(111.75±17.16°C,84.58±17.41°C,P0.01),兩組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。D組2分鐘內(nèi)消融中心溫度最高可以達(dá)到130度左右,B組107度左右。紅外成像顯示D組的消融面積大于B組;D組在消融25S的時(shí)間,平均溫度升高到60℃,最高溫度可以超過100℃,B組在消融2min的時(shí)間內(nèi),最高溫度低于60℃,其兩組的平均溫度(77.17±16.97℃,47.2±4.57℃,P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組兔VX2腫瘤治療24小時(shí),腫瘤殘留體積的對比(486.6±63.54mm3,271.6±52.08mm3),二者相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)術(shù)后24h,D組腫瘤內(nèi)的阿霉素免疫熒光明顯高于C組(3)術(shù)后24小時(shí),D組殘瘤細(xì)胞的電鏡觀察,細(xì)胞核明顯固縮、核膜增厚、染色質(zhì)凝聚,核內(nèi)可見黑色高電子密度顆粒的二氧化鋯;C組殘瘤細(xì)胞的電鏡觀察,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、核大細(xì)胞質(zhì)少、細(xì)胞核不規(guī)則、可見分裂相。(4)治療前先對4組動(dòng)物的基線腫瘤體積進(jìn)行比較(P0.05),四組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療后1天、3天、6天、9天,我們進(jìn)行了CT圖像掃描:A組腫瘤體積明顯增大,B組及C組體積增大次之,D組在治療后病灶體積無明顯變化。D組與其它三組比較,術(shù)后3天、6天、9天腫瘤體積差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);B組與C組之間術(shù)后3天,6天、9天腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),與A組之間在治療后3天,6天,9天的腫塊體積大小差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(5)術(shù)前四組腫塊體大小比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.249,P=0.861),術(shù)后1天,3天,6天,9天D組與其它三組活性腫瘤體積大小有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);B組和C組與A組之間活性腫瘤體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);B組與C組在術(shù)后1天活性腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),術(shù)后3天活性腫瘤體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001),術(shù)后6天活性腫瘤無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。MR圖像顯示D組的腫瘤活性組織體積明顯縮小,只有病灶邊緣殘留少量腫瘤組織,其它三組腫瘤活性組織明顯增大,特別是A組腫瘤活性組織增大特別明顯。(6)D組腫瘤組織內(nèi)可見滿視野的壞死細(xì)胞,未見明顯腫瘤細(xì)胞,B組及C組內(nèi)可見腫瘤細(xì)胞染色,其內(nèi)可見壞死區(qū),A組內(nèi)可見大量的腫瘤細(xì)胞,壞死不明顯(7)D組與C組介入術(shù)后3天,AST,ALT明顯升高,二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且分別與B組及A組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),;術(shù)后6天,D組與C組AST,ALT明顯降低,術(shù)后9天,與A組及B組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。四組之間3,6,9天的BUN,Cr之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(8)D組、C組及B組術(shù)后3天,WBC明顯升高,與A組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),6天后WBC明顯降低,第9天各組之間WBC無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);RBC,HCT,HGB,MCV,MCH,MCHC,PLT各組之間3-6-9天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(9)D組與C組動(dòng)物的體重3天體重減輕,3天后體重增加,第9天與A組及B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05).結(jié)論:1、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球能夠起到微波增敏作用,增加消融體積。2、微波可以加速mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球中阿霉素的釋放。3、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球在活體內(nèi)是安全、無毒副作用的。4、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)輔助微波消融,可以起到栓塞、化療、微波三位一體的治療作用,大大的提高了腫瘤治療的療效。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

mPEG-PLGA 骨架， ZrO2，1-丁基 -3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和阿霉素，證明了ZrO2@(DOX+ILS)被成功包覆到微球當(dāng)中(圖 3.1G)。圖3.1 空白材料（mPEG-PLGA）A:光學(xué)顯微鏡照片 B:掃描電鏡照片 C:粒度統(tǒng)計(jì)；mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球 D：光學(xué)照片 E：掃描電鏡照片 F：粒度統(tǒng)計(jì)G：SEM-EDS 能譜分析.

2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)隨著濃度的增加而亮度升高，CT 值升高，呈線性關(guān)系（如圖 3.2A-B 所示）圖3.2A: mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的溶液體外CT影像; B:濃度與CT值的線性關(guān)系3.3 體外微波增敏功能消融中心區(qū)的溫度微球組與對照組分別為(30±7.49℃,17±5.63℃)，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）（圖 3.3A）；距離消融中心 1cm 區(qū)域的溫度微球組與對照組分別為(18.51±7.64℃,6.91±1.91℃），兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）（圖 3.3B）。熱紅外成像顯示,微球組有更好的升溫效果和更大的消融面積（圖 3.3C)。微球組的消融面積比對照組提高了 30.6%（圖 3.3D）。

圖 3.3:A 兩組消融中心區(qū)域的溫度升高曲線; B 距離消融中心區(qū)域 1cm 的溫度升高曲線;C 兩組消融區(qū)域的紅外成像; D 兩組消融面積比較3.4 不同溫度下 ZrO2@(ILs+DOX)釋放的體外實(shí)驗(yàn)在 37℃下，掃描電鏡觀察微球的形貌（圖 3.4A）并未發(fā)生明顯變化。透視電鏡下，釋放后的上清液僅僅發(fā)現(xiàn)極少的 ZrO2@(DOX+ILS（)圖 3.4C）；而在 65℃下，掃描電鏡觀察微球出現(xiàn)變形破裂的現(xiàn)象(圖 3.4B)。透射電鏡下，釋放后的上清液中出現(xiàn)了大量的 ZrO2@(DOX+ILS)（圖 3.4D）。
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