發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 13:35

　　 睪丸是對(duì)化療藥物高度敏感的器官,化療后出現(xiàn)不同程度睪丸功能損傷的患者越來(lái)越多,嚴(yán)重影響男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1,2]治療常用的化療藥。針對(duì)體內(nèi)異常增殖的腫瘤細(xì)胞,THP能夠造成細(xì)胞DNA損傷,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而,體內(nèi)分裂活躍的細(xì)胞,如生殖細(xì)胞,對(duì)于化療藥物表現(xiàn)出高度敏感性。鋅指蛋白146(Ring finger protein,RNF146)是一種新近發(fā)現(xiàn)的具有E3泛素連接酶活性的DNA損傷反應(yīng)蛋白[3]。預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)其在成年雄性小鼠睪丸組織中高表達(dá)。RNF146在新生小鼠睪丸組織中表達(dá)極低,隨著性發(fā)育表達(dá)水平迅速升高。這一現(xiàn)象引起了我們的重視,然而仍有一些問(wèn)題需要深入探索。RNF146在成年小鼠睪丸精原細(xì)胞中高表達(dá)的意義是什么?小鼠化療后精原細(xì)胞的DNA損傷與RNF146之間存在聯(lián)系嗎?RNF146能否作為化療后改善精原細(xì)胞DNA損傷的靶點(diǎn)呢?為此,我們進(jìn)行了下列兩部分研究工作:第一部分RNF146在小鼠睪丸組織中的表達(dá)及定位特點(diǎn)目的:明確DNA損傷反應(yīng)蛋白R(shí)NF146在小鼠睪丸組織中的表達(dá)規(guī)律及細(xì)胞定位特點(diǎn)。方法:取成年雄性C57小鼠8只,分別提取包括睪丸在內(nèi)的主要組織器官總蛋白,通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)RNF146表達(dá)的組織特異性。取新生、7日齡、1月齡、3月齡和1年齡雄性C57小鼠各5只,提取一側(cè)睪丸組織總蛋白,經(jīng)Western-blot觀察C57小鼠睪丸組織中RNF146的表達(dá)規(guī)律,另一側(cè)睪丸組織制備石蠟切片。通過(guò)HE染色、免疫組化和免疫熒光染色明確小鼠睪丸組織中RNF146與生精細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系及成年小鼠睪丸曲精小管中RNF146細(xì)胞定位特點(diǎn)。結(jié)果:Western-blot結(jié)果提示在成年雄性C57小鼠全身各臟器中,RNF146主要表達(dá)于肺、睪丸、腦和脾等臟器中,肝、腎及胃中表達(dá)水平極低;隨著小鼠的性發(fā)育,睪丸組織中RNF146表達(dá)水平迅速升高,老年鼠睪丸組織中RNF146表達(dá)降低。免疫組化和免疫熒光染色提示成年雄性小鼠睪丸組織中RNF146主要定位在曲精小管精原細(xì)胞上,間質(zhì)血管及支持細(xì)胞幾乎不表達(dá)。結(jié)論:RNF146在正常成年雄性C57小鼠各器官中表達(dá)具有組織特異性,肺、睪丸及腦是其主要表達(dá)臟器。睪丸中RNF146的表達(dá)水平隨小鼠性發(fā)育迅速升高,老年階段降低。成年小鼠睪丸組織中RNF146主要定位在曲精小管的精原細(xì)胞區(qū)域,提示其可能與精原細(xì)胞的功能有關(guān)。第二部分RNF146對(duì)吡柔比星引起的小鼠睪丸精原細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用目的本實(shí)驗(yàn)以小鼠睪丸精原細(xì)胞株GC-1為細(xì)胞模型,通過(guò)包裝RNF146過(guò)表達(dá)慢病毒及對(duì)照病毒,感染GC-1細(xì)胞,采用吡柔比星干預(yù)的方法復(fù)制精原細(xì)胞DNA損傷模型。觀察基因rnf146是否對(duì)化療藥吡柔比星干預(yù)所引起的精原細(xì)胞株GC-1 DNA損傷具有保護(hù)作用。方法以小鼠睪丸組織總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成c DNA,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增rnf146片段,將片段與載體p CDH連接以構(gòu)建p CDH-rnf146重組質(zhì)粒,以Lipofectamine?3000為介質(zhì)將重組質(zhì)粒p CDH-rnf146、載體對(duì)照質(zhì)粒p CDH-egfp以及包裝質(zhì)粒ps PAX2、p MD2.G共轉(zhuǎn)H E K293T細(xì)胞包裝病毒。以小鼠睪丸精原細(xì)胞株GC-1為觀察對(duì)象,設(shè)置Blank、Lenti-EGFP及Lenti-RNF146三組GC-1細(xì)胞,采用L enti-RN F146過(guò)表達(dá)慢病毒感染的方法復(fù)制RNF146過(guò)表達(dá)的GC-1細(xì)胞模型,無(wú)關(guān)病毒Lenti-EGFP感染組為平行對(duì)照,通過(guò)Western blot鑒定Lenti-RNF146在GC-1細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效率。采用吡柔比星處理的方法復(fù)制GC-1細(xì)胞的DNA損傷模型,Brd U摻入標(biāo)記實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)吡柔比星對(duì)GC-1細(xì)胞增殖的影響并確定最佳干預(yù)濃度,彗星實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)吡柔比星對(duì)GC-1細(xì)胞DNA完整性的影響,Tunel染色分析吡柔比星對(duì)GC-1細(xì)胞凋亡的影響。在吡柔比星干預(yù)的GC-1、L enti-EG FP/GC-1和Lenti-RNF146/GC-1三種細(xì)胞模型中,通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)、T UN EL染色分析RNF146對(duì)吡柔比星引起的GC-1細(xì)胞增殖抑制、凋亡增多及D NA損傷的保護(hù)作用。結(jié)果成功構(gòu)建了小鼠p CDH-rnf146重組質(zhì)粒并包裝得到了RNF146過(guò)表達(dá)慢病毒,Western blot結(jié)果提示Lenti-RNF146過(guò)表達(dá)慢病毒能夠顯著上調(diào)GC-1細(xì)胞中RNF146的表達(dá)效率。1.0μg/m L為吡柔比星干預(yù)GC-1細(xì)胞的最佳處理濃度。Brd U摻入標(biāo)記顯示RNF146能夠減輕吡柔比星引起的GC-1細(xì)胞增殖抑制。TUNEL染色提示RNF146能夠緩解吡柔比星誘導(dǎo)的GC-1細(xì)胞凋亡。彗星實(shí)驗(yàn)顯示RNF146過(guò)表達(dá)能夠有效保護(hù)吡柔比星作用下GC-1細(xì)胞DNA的完整性。結(jié)論RNF146對(duì)化療藥吡柔比星引起的小鼠睪丸精原細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R730.53
【部分圖文】：

與心臟組織相比，*P<0.051-1 免疫印跡分析小鼠各臟器中 RNF146 表達(dá) RNF146 在睪丸組織中表達(dá)迅速增加1d）、七日齡（7d）、一月齡（1m）、三月睪丸組織總蛋白，以 GAPDH 為內(nèi)參，抗丸組織中 RNF146 表達(dá)水平。圖 1-2 可見(jiàn)表達(dá)，隨年齡增加，RNF146 表達(dá)升高，

Western-blot分析不同年齡雄性小鼠睪丸組織RNF146表達(dá)水平

組織形態(tài)學(xué)變化。鏡下可見(jiàn)一日齡小鼠睪丸組織曲精小管內(nèi)細(xì)胞層數(shù)少胞類型單一，核染色較深，多為原始生精細(xì)胞（精原細(xì)胞）和支持細(xì)胞（-3 A）。七日齡小鼠睪丸組織曲精小管直徑加粗，細(xì)胞層數(shù)增加，細(xì)胞類以精原細(xì)胞為主（圖 1-3 B）。兩周齡小鼠睪丸組織曲精小管直徑繼續(xù)加寬近基底膜處主要為精原細(xì)胞，向管中方向出現(xiàn)具有分裂相的精母細(xì)胞（-3 C）。三周齡小鼠睪丸組織曲精小管直徑繼續(xù)加寬，細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)型復(fù)雜，基底膜向曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞依次為精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次母細(xì)胞（圖 1-3 D）。一月齡的小鼠已趨于性成熟，部分曲精小管管腔有精子細(xì)胞及甚至變形精子出現(xiàn)，曲細(xì)精管內(nèi)有空腔形成（圖 1-3 E）。三小鼠睪丸組織不同分期的曲精小管中細(xì)胞排列整齊，部分管腔可見(jiàn)梭形和成熟的精子（圖 1-3 F）。
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本文編號(hào)：2844851