【研究背景及目的】慢性炎癥始終伴隨著膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一個重要的炎癥刺激因子,我們的前期實驗已證實它可以通過激活NF-κB介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)表達(dá),從而促進(jìn)膽囊癌微淋巴管生成。受體相互作用蛋白1(RIP1)是TNF-α信號通路中調(diào)控細(xì)胞存亡的一個重要因子,在膽囊癌組織中呈高表達(dá)。然而,RIP1是否參與TNF-α信號通路誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膽囊癌微淋巴管的生成仍未知。本項目擬闡明RIP1調(diào)控膽囊癌細(xì)胞TNF-α-NF-κB-VEGF-C信號通路的機制及在膽囊癌微淋巴管形成中的作用�！痉椒ā�1、用不同濃度的TNF-α刺激膽囊癌細(xì)胞株NOZ和GBC-SD,通過Western blot檢測膽囊癌細(xì)胞中RIP1蛋白水平的變化,以確定TNF-α最佳的刺激濃度和時間。2、以慢病毒RIP1-shRNA和siIκBα分別轉(zhuǎn)染兩株膽囊癌細(xì)胞株NOZ和GBC-SD,構(gòu)建RIP1和IκBα沉默的細(xì)胞株,用PcDNA3.1-RIP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RIP1沉默的細(xì)胞株,構(gòu)建回復(fù)表達(dá)的細(xì)胞株。3、通過Western blot檢測IκBα、p-IκBα、TAK1、NEMO、VEGF-C蛋白的表達(dá)情況;用ELISA試驗檢測上清液VEGF-C蛋白水平;用雙熒光素酶報告法定量檢測VEGF-C啟動子和NF-κB活性;用染色質(zhì)免疫沉淀試驗(ChIP)分析NF-κB與VEGF-C啟動子的關(guān)系,于此來驗證RIP1在TNF-α-NF-κB-VEGF-C信號通路中的作用。4、用三維共培養(yǎng)法(膽囊癌細(xì)胞+淋巴內(nèi)皮細(xì)胞)和原位移植裸鼠模型的體內(nèi)外實驗來評估RIP1對TNF-α誘導(dǎo)的膽囊癌微淋巴管形成和淋巴轉(zhuǎn)移的影響。5、用免疫組化方法檢測人膽囊癌組織標(biāo)本中RIP1、TNF-α和淋巴管密度的表達(dá)情況,分析了RIP1蛋白與TNF-α蛋白以及淋巴管密度的相關(guān)性。【結(jié)果】1、TNF-α可以促進(jìn)NOZ和GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株RIP1蛋白的表達(dá),并呈濃度和時間的依賴性,50ng/ml的TNF-α是刺激RIP1蛋白表達(dá)的最佳濃度。2、在NOZ和GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株中,RIP1是TNF-α激活NF-κB活性的必需因子。當(dāng)沉默RIP1的表達(dá)后,TNF-α激活NF-κB的能力受到明顯影響,而回復(fù)表達(dá)RIP1后,可以恢復(fù)TNF-α激活NF-κB的能力;而當(dāng)IκBα與RIP1共沉默時,也恢復(fù)了TNF-α激活NF-κB的能力。免疫共沉淀顯示RIP1與TAK1、NEMO蛋白之間存在著相互作用的關(guān)系。表明TNF-α通過RIP1與TAK1、NEMO的相互作用磷酸化IκBα,從而導(dǎo)致IκBα的降解,進(jìn)而激活NF-κB。3、RIP1通過NF-κB通路調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的VEGF-C表達(dá)。沉默RIP1或加入NF-κB抑制劑的NOZ和GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株中:TNF-α誘導(dǎo)的VEGF-C啟動子的活性減弱;TNF-α誘導(dǎo)的VEGF-C蛋白的表達(dá)也減弱,而回復(fù)表達(dá)沉默的RIP1后,可以恢復(fù)TNF-α誘導(dǎo)的VEGF-C蛋白的表達(dá)。此外,ChIP實驗也證實了當(dāng)沉默了RIP1后,TNF-α增強NF-κB和VEGF-C啟動子結(jié)合的能力減弱。4、在體外實驗中,RIP1可以調(diào)控TNF-α-VEGF-C軸介導(dǎo)的NOZ和GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株對淋巴內(nèi)皮細(xì)胞成管能力。在沉默RIP1的NOZ或GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)實驗中,TNF-α刺激增加的淋巴成管的數(shù)目減少,而當(dāng)回復(fù)表達(dá)RIP1后,淋巴成管的數(shù)目得到了恢復(fù)。而在沉默RIP1的膽囊癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入VEGF-C蛋白也部分恢復(fù)了TNF-α誘導(dǎo)的淋巴成管的數(shù)目,說明了RIP1可以調(diào)控TNF-α介導(dǎo)的膽囊癌細(xì)胞對微淋巴管生成的影響,且主要與VEGF-C蛋白水平有關(guān)。5、在裸鼠的原位種植瘤模型中,RIP1可以調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的膽囊癌淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。沉默RIP1的NOZ膽囊癌細(xì)胞株移植模型中:TNF-α刺激所致的裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率減少;免疫組化檢測淋巴管密度(LVD)證實了TNF-α誘導(dǎo)的膽囊癌淋巴管生成減少。6、收集30例膽囊癌組織石蠟標(biāo)本,通過免疫組織化學(xué)法檢測TNF-α、RIP1、LVD的表達(dá),分析RIP1與TNF-α、LVD的相關(guān)性,結(jié)果表明RIP1的表達(dá)與TNF-α的表達(dá)以及LVD呈正相關(guān)�！窘Y(jié)論】1、TNF-α增強膽囊癌細(xì)胞RIP1蛋白的表達(dá)并呈濃度、時間依賴性。2、RIP1是TNF-α激活膽囊癌細(xì)胞NF-κB活性的必需因子。3、RIP1通過NF-κB信號通路調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的膽囊癌VEGF-C的表達(dá),從而影響了膽囊癌微淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

25圖 1.1 pNFκB-luc 熒光素酶報告質(zhì)粒的圖譜2.7.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1）將 20μl 連接產(chǎn)物加入 100μl DH5α感受態(tài)(CaCl2方法制備)中，冰30min。2）42℃，熱休克 2min。3）快速置于冰浴 2min。4）加入 800μl 無抗生素抗性 LB 培養(yǎng)液，37℃，200g 震蕩培養(yǎng) 40min。5）4000g、離心 2min 收集細(xì)菌。6）棄 800μl 上清，留 100μl 重懸細(xì)菌沉淀。7）將沉淀全部涂布于含 100μg/ml 氨芐青霉素的 LB 平板，37℃恒溫培

圖 1.2 Western bolt 檢測不同濃度 TNF-α 刺激膽囊癌細(xì)RIP1 蛋白表達(dá)情況圖 1.3 Western bolt 檢測結(jié)果半定量分析不同濃度 TNF-α 刺激

Westernbolt檢測結(jié)果半定量分析不同濃度TNF-α刺激膽囊癌細(xì)胞RIP1蛋白表達(dá)情況（*p<0.05,**p<0.01）
【參考文獻(xiàn)】

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1 蔣雷;陳燕凌;佘菲菲;唐南洪;李秀金;王曉茜;;膽囊癌組織中血管內(nèi)皮生長因子C和D的表達(dá)及其與淋巴管和血管生成的關(guān)系[J];中華腫瘤雜志;2010年03期

2 周連鎖,石景森,王作仁,王林;腫瘤壞死因子在膽囊癌及結(jié)石組織中的表達(dá)[J];癌變.畸變.突變;2000年03期

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1 朱廣偉;RIP-1促進(jìn)膽囊癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：2844358