研究背景及目的:業(yè)已證明TNF-α具有促進膽囊癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。然而作為TNF-α-TNFR1信號通路的關(guān)鍵蛋白RIP1(receptor-interacting protein-1,受體相互作用蛋白-1),其對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用及其具體的分子機制鮮見報道。本研究擬圍繞以下問題開展實驗:RIP1在膽囊癌中的表達及與臨床參數(shù)之間的關(guān)系;進一步進行體外細胞實驗,探討RIP1對膽囊癌細胞增殖、凋亡、侵襲及對VEGF-C表達的影響及其機制。方法:收集60例膽囊癌和17例癌旁正常組織石蠟標本,通過免疫組織化學法檢測RIP1的蛋白表達;結(jié)合臨床資料分析RIP1表達與臨床參數(shù)間的關(guān)系。通過RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測3個膽囊癌細胞株中RIP1的表達情況。通過RNAi技術(shù)特異性的沉默膽囊癌細胞中RIP1;RT-PCR、Western-blot驗證;通過細胞增殖實驗(MTT)、Transwell小室侵襲實驗、流式細胞儀檢測凋亡實驗檢測RIP1基因沉默對膽囊癌細胞生物學行為的影響。通過Western-blot分析RIP1基因沉默對AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、p-c-jun(p-AP-1)、VEGF-C蛋白表達的影響。構(gòu)建VEGF-C啟動子截短缺失體片段及各個突變體雙熒光素酶報告載體,用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測各啟動子片段活性,確定VEGF-C啟動子關(guān)鍵活性區(qū)域,通過生物信息學分析預測關(guān)鍵活性區(qū)域存在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、通過重疊PCR方法定點誘變技術(shù)突變特定轉(zhuǎn)錄因子位點對VEGF-C啟動子活性的影響、進一步細胞外實驗凝膠電泳遷移率阻滯實驗(EMSA)和活體細胞實驗染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(Ch IP)確定RIP1通過NF-κB和AP-1調(diào)控VEGF-C基因啟動子的活性。結(jié)果:1 RIP1在膽囊癌組織中的表達(MOD值=0.3134±0.0802)顯著高于膽囊正常組織(MOD值=0.1345±0.1220),P0.0001;RIP1的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級無關(guān);而RIP1的表達與膽囊癌患者的臨床分期(I~III vs.IV~V;P=0.0021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無轉(zhuǎn)移組vs.有轉(zhuǎn)移組;P=0.047)和有無結(jié)石(有結(jié)石vs.無結(jié)石;P=0.0382)相關(guān)。2 RIP1的m RNA和蛋白在三株膽囊癌細胞系均有表達,NOZ細胞RIP1蛋白表達最強。構(gòu)建的沉默質(zhì)粒P-1/si RNA—P-4/si RNA中P-1/si RNA最大程度沉默了NOZ細胞的RIP1表達,差異有統(tǒng)計學意義P0.05。P-1/si RNA組細胞增殖比NC/si RNA組和control組(即未轉(zhuǎn)染組)細胞緩慢(P0.05),而NC/si RNA組和control組細胞增殖無差異(P0.05)。P-1/si RNA組細胞穿到下室的細胞數(shù)比NC/si RNA組和control組細胞數(shù)目少,差異有統(tǒng)計學意義P0.05;而NC/si RNA組和control組穿到下室的細胞數(shù)目無差異(P0.05)。P-1/si RNA、NC/si RNA和control組膽囊癌細胞的凋亡情況無差異。P-1/si RNA組細胞中AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、pc-jun(p-AP-1)蛋白表達量比NC/si RNA組和control組表達量少,差異有統(tǒng)計學意義P0.05;而NC/si RNA組和control組表達無差異(P0.05)。P-1/si RNA組VEGF-C m RNA和蛋白的表達量比NC/si RNA組和control組表達量減少,結(jié)果有顯著差異P0.05;而NC/si RNA組和control組VEGF-C m RNA和蛋白表達無差異(P0.05)。3-332bp到-190bp是VEGF-C啟動子保持轉(zhuǎn)錄表達活性的關(guān)鍵區(qū)域。VEGF-C啟動子片段PGL3B-332的熒光活性隨著RIP1的表達升高而升高,呈劑量效應增加;發(fā)現(xiàn)VEGF-C啟動子-332bp至-190bp區(qū)域存在兩個交錯重疊的AP-1位點(-207 to-192bp GGCGCGTCAGTCATG;兩個AP-1位點分別為:GGCGCGTCAGT和CGTCAGTCATG),調(diào)控VEGF-C啟動子活性。4證實RIP1可激活NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在VEGF-C啟動子-332bp至-190bp區(qū)域,增強VEGF-C啟動子活性;結(jié)論:1 RIP1在膽囊癌組織中的表達顯著增加;RIP1的表達與膽囊癌患者的臨床分期、有無結(jié)石以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。2 RIP1促進膽囊癌細胞的增殖和侵襲,對凋亡無影響;RIP1促進膽囊癌細胞RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信號通路分子的表達。3-332bp到-190bp是VEGF-C啟動子保持轉(zhuǎn)錄表達活性的關(guān)鍵區(qū)域。在VEGFC啟動子-332bp到-190bp區(qū)域存在兩個AP-1結(jié)合位點,是調(diào)控VEGF-C啟動子活性的重要位點。4 RIP1通過NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子與VEGF-C基因啟動子結(jié)合位點結(jié)合調(diào)控VEGF-C啟動子的活性,從而影響VEGF-C的表達。
【學位單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.8
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分RIP1在膽囊癌組織中的表達及其臨床意義
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第二部分RIP1沉默對膽囊癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機制
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第三部分RIP1調(diào)控膽囊癌細胞分泌VEGF-C的分子機制
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
綜述:RIP1:細胞存活與腫瘤
    參考文獻
攻讀學位期間完成的學術(shù)論文
致謝

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張利霞;沈云志;邱全興;汪良芝;秦怡;;膽汁中IL-6、TNF-α、IL-8檢測對急性膽管炎診斷和嚴重程度的判斷價值[J];國際消化病雜志;2008年04期

本文編號：2844168