食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,國際癌癥研究中心(IARC)全球癌癥統(tǒng)計報告指出:2012年食管癌發(fā)病人數(shù)為323,000人;2012年食管癌死亡人數(shù)為281,200人,說明其具有高發(fā)生率和高致死性的特征。我國是食管癌的高發(fā)國家,其中尤以食管鱗癌最為常見。食管癌患者就診時多處于中晚期,相當部分的病人已不能手術(shù)治療,總的五年生存率僅為10%-20%。為此,探索食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ),尋找相關(guān)的腫瘤標志物,對于食管鱗癌的早期診斷及治療具有十分重要的意義。MicroRNA(miRNA)是近年來研究較多的一類內(nèi)源性、約22個核苷酸長度的非編碼RNA,可通過結(jié)合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)以促使m RNA降解或者抑制其蛋白翻譯,并參與轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控。研究表明miRNAs在胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生命過程中均可以發(fā)揮作用,在人類疾病中具有潛在的臨床診斷和治療意義。越來越多的研究證實mi RNAs具有癌基因或抑癌基因作用,可直接參與人類多種腫瘤的形成與發(fā)展。此外,也有研究表明miRNAs在腫瘤中的異常表達具有一定的組織和細胞特異性。因此,深入研究mi RNAs在人體腫瘤中的表達及其作用功能,對認識不同組織類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制具有十分重要的意義,同時也將有利于腫瘤的靶向治療。近年來的研究報道了許多參與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的miRNAs并闡述了其作用機制,這為探索食管鱗癌發(fā)病機理的研究提供了豐富的理論認識。為了尋找新的可能成為診斷指標或治療靶點的mi RNAs,課題組前期利用食管鱗癌組織及其對應(yīng)的正常食管組織樣本,采用mi RNAs表達譜芯片技術(shù),對食管鱗癌組織中異常表達的miRNAs進行篩選。我們共檢測到差異表達的mi RNAs 129條(上調(diào)69條,下調(diào)60條),其中包含一些已被鑒定過的mi RNAs,例如mi R-21、mi R-9、miR-129、miR-375等。同時,我們結(jié)合其他研究組報道的不同腫瘤中的mi RNA表達譜數(shù)據(jù)以排除一些具有腫瘤廣泛性的mi RNAs。最后,mi R-330-3p(Fold change=2.03)和mi R-26b(Fold change=0.49)引起了我們的關(guān)注。目前關(guān)于mi R-330在腫瘤中表達和功能研究的報道并不多,并且已有結(jié)論提示mi R-330在不同腫瘤中的表達有所差異。而對于mi R-26b的研究結(jié)果普遍認為它在多種腫瘤中表達下調(diào),可能是個抑癌基因樣的mirna分子。然而迄今為止,關(guān)于mir-330-3p和mir-26b在食管鱗癌中表達和功能的研究尚未有報道。為此,我們選擇這兩個mirnas作為后續(xù)研究對象。本課題首先研究了mir-330-3p和mir-26b在食管鱗癌細胞系以及腫瘤組織中的表達情況,試圖闡明它們在食管鱗癌中的表達特性。然后,采用外源性轉(zhuǎn)染的方法檢測過表達或干擾mirnas后食管鱗癌細胞生長、增殖、凋亡以及遷移侵襲等情況,以進一步明確mir-330-3p和mir-26b對食管鱗癌細胞生物學行為的影響。最后,預(yù)測并鑒定了mirnas可能發(fā)揮作用的下游靶基因,同時也對它們受到的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了初步探討。本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.mir-330-3p在食管鱗癌中的功能及其調(diào)控機制研究1.1mir-330-3p在食管鱗癌中的表達及其生物學功能研究首先采用實時熒光定量pcr方法檢測mir-330-3p在食管鱗癌細胞株和組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常食管上皮細胞het-1a相比,mir-330-3p在兩種食管鱗癌細胞株(ec109和kyse150)中均表達上調(diào);35例配對食管鱗癌樣本中mir-330-3p在癌組織中表達顯著上調(diào)。進一步采用cck8實驗、流式細胞儀技術(shù)、edu細胞增殖實驗、transwell細胞遷移侵襲實驗以及裸鼠皮下成瘤實驗對mir-330-3p進行功能分析。在ec109細胞中瞬時轉(zhuǎn)染mir-330-3pmimics和無關(guān)對照mimicsnc,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達mir-330-3p后,可顯著加快ec109細胞生長,促進細胞增殖、遷移和侵襲,并且可抵抗由順鉑引起的細胞凋亡;而在kyse150細胞中轉(zhuǎn)染mir-330-3pinhibitor,與對照inhibitornc相比,干擾了mir-330-3p后可抑制kyse150細胞生長、增殖,誘導細胞g1期阻滯以及增加細胞凋亡的發(fā)生。此外,我們還檢測了mir-330-3p對食管鱗癌細胞中一些細胞周期相關(guān)基因表達的改變。westernblot結(jié)果顯示增加ec109細胞中mir-330-3p表達水平,可顯著上調(diào)細胞周期正向調(diào)控分子cyclina、cdk6的蛋白表達,同時可下調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、p27的蛋白水平。熒光定量pcr結(jié)果也發(fā)現(xiàn)mir-330-3p可顯著上調(diào)ccnd1、ccnd2、cdk4、c-myc的mrna表達。同樣地,在kyse150細胞中下調(diào)mir-330-3p表達后可觀察到相反的效應(yīng)。最后,裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn)過表達mir-330-3p組的ec109細胞皮下成瘤能力較對照組明顯增強。以上體內(nèi)、體外實驗結(jié)果均提示mir-330-3p可以促進食管鱗癌細胞生長,說明mir-330-3p在食管鱗癌中可能是個癌基因樣的mirna分子。1.2pdcd4是mir-330-3p直接調(diào)控的靶基因我們通過targetscan,miranda和pictar等網(wǎng)站進行生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)pdcd4可能受到mir-330-3p的調(diào)控。采用熒光素酶報告基因?qū)嶒�、實時熒光定量pcr及westernblot等方法驗證pdcd4是否為參與mir-330-3p調(diào)控的下游靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-330-3p無論是在mrna水平或蛋白水平均可降低pdcd4的表達。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示:含有野生型pdcd43’utr的載體與mir-330-3pmimics共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性顯著下降,而突變結(jié)合位點后熒光素酶活性有所回升。進一步采用實時熒光定量pcr方法檢測pdcd4在食管鱗癌組織中的表達情況,并分析其與mir-330-3p表達的相關(guān)性。q-pcr結(jié)果顯示:與癌旁正常組織相比,pdcd4在35例食管鱗癌腫瘤組織中表達顯著下調(diào)。通過測定mir-330-3p和pdcd4在食管鱗癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中的mrna表達,我們發(fā)現(xiàn)二者表達水平呈負相關(guān)(r=-0.5421,p=0.0008)。1.3pdcd4在食管鱗癌細胞中的功能研究采用特異的pdcd4sirna化學片段轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞,分別以cck8實驗、流式細胞儀技術(shù)、edu細胞增殖實驗、transwell細胞遷移侵襲實驗檢測干擾pdcd4后細胞生物學行為的改變。結(jié)果顯示在ec109和kyse150細胞中干擾pdcd4表達,細胞生長速度加快、細胞增殖能力、遷移和侵襲能力也明顯增強,同時也可抵抗由順鉑誘導的細胞凋亡。上述實驗結(jié)果均提示pdcd4可能為mir-330-3p發(fā)揮功能的潛在下游靶點。2.mir-26b在食管鱗癌中的功能及其調(diào)控機制研究2.1mir-26b在食管鱗癌細胞株和腫瘤及癌旁組織中的表達情況mirna芯片結(jié)果提示mir-26b在腫瘤組織中表達下調(diào)。為了驗證這一結(jié)果,我們采用sybr-greenqrt-pcr方法檢測了mir-26b在42對食管鱗癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況。結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比,mir-26b在食管鱗癌組織中的表達顯著下調(diào)。進一步結(jié)果顯示與正常食管上皮細胞het-1a相比,mir-26b在食管鱗癌細胞株中kyse150和kyse450中也表達下調(diào)。2.2mir-26b在食管鱗癌細胞中的生物學功能研究由于mir-26b在食管鱗癌細胞和組織中的低表達,我們進一步采用cck8實驗、流式細胞儀技術(shù)、edu細胞增殖等實驗對mir-26b進行功能分析。結(jié)果顯示上調(diào)mir-26b的表達水平可抑制食管鱗癌細胞生長;edu結(jié)果提示過表達mir-26b后實驗組細胞增殖能力較對照組明顯降低;流式細胞術(shù)結(jié)果也顯示過表達mir-26b組的細胞發(fā)生了明顯的g1期細胞阻滯,并且干擾了mir-26b后可明顯拮抗由順鉑引起的凋亡。以上實驗結(jié)果提示mir-26b在食管鱗癌中表達下調(diào),并且可以發(fā)揮抑制食管鱗癌細胞生長的作用。2.3mycbp可能是參與mir-26b發(fā)揮抑制生長作用的下游靶基因鑒于mir-26b在食管鱗癌細胞中發(fā)揮的生長抑制作用,我們通過targetscan,miranda和pictar等網(wǎng)站預(yù)測其可能發(fā)揮功能的下游靶基因。經(jīng)過篩選,我們發(fā)現(xiàn)c-myc結(jié)合蛋白mycbp的3’utr可以與mir-26b互補結(jié)合。我們在ec109、kyse150和kyse450細胞中分別轉(zhuǎn)染化學合成的mir-26bmimics后發(fā)現(xiàn)mir-26b可以顯著下調(diào)三種細胞中mycbp的mrna表達水平。熒光素酶報告基因?qū)嶒炓策M一步提示mir-26b可以通過該結(jié)合位點抑制mycbp的轉(zhuǎn)錄活性,說明mycbp可能受到了mir-26b的負調(diào)控。此外,我們還研究了mycbp在食管鱗癌中的功能。采用特異的mycbpsirna化學片段轉(zhuǎn)染kyse450細胞,分別以cck8、edu細胞增殖實驗以及流式細胞術(shù)檢測干擾mycbp后細胞生物學行為的改變。結(jié)果顯示kyse450細胞中mycbp被抑制后可以發(fā)揮與mir-26b相似的效應(yīng),以上均提示mycbp可能是mir-26b發(fā)揮作用的潛在下游靶基因。3.nf-κb調(diào)控mirnas參與抑制食管鱗癌細胞生長的機制研究3.1mir-330-3p、mir-26b啟動子區(qū)均含有轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的結(jié)合位點根據(jù)ucsc網(wǎng)站提供的sno/mirna數(shù)據(jù)結(jié)合encoderegulation、cpgisland、encodetfbinding以及tfbsconserved等數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在mir-330-3p、mir-26b基因啟動子區(qū)都含有轉(zhuǎn)錄因子nf-κbp65的結(jié)合位點,此外在相同的位置也顯示出很強的ii型rna聚合酶的信號,這些都提示nf-κb很可能參與這兩個mirna的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。3.2nf-κbp65對mirnas的表達改變我們在ec109細胞中瞬時轉(zhuǎn)染nf-κbp65表達質(zhì)粒,q-pcr結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達p65后可下調(diào)mir-330-3p的表達,而上調(diào)mir-26b的表達。由此提示在食管鱗癌細胞ec109中,mir-330-3p和mir-26b的表達可能會受到nf-κb的影響。3.3nf-κbp65與mirnas基因調(diào)控區(qū)結(jié)合情況我們通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chip)進一步探討這兩個mirnas基因調(diào)控區(qū)與nf-κb的結(jié)合情況。首先,我們在ec109細胞中轉(zhuǎn)染p65后檢測nf-κb與mir-330-3p的結(jié)合情況,結(jié)果顯示在該結(jié)合位點處nf-κbp65、p50的富集均高于對照組igg。接下來我們針對nf-κb與mir-26b的結(jié)合位點設(shè)計pcr引物,結(jié)果同樣顯示過表達nf-κb后,該結(jié)合位點處p65的富集較對照組顯著增高。3.4nf-κb對mir-330-3p轉(zhuǎn)錄活性的影響chip實驗已經(jīng)證實nf-κb可以與mir-330-3p基因調(diào)控區(qū)結(jié)合,因此我們推測nf-κb是否也可以影響它的轉(zhuǎn)錄活性。我們構(gòu)建了含有nf-κb和mir-330-3p結(jié)合位點的野生型報告基因載體以及相應(yīng)的突變或缺失該結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體進行啟動子活性的檢測。結(jié)果顯示NF-κB可以與miR-330-3p啟動子區(qū)結(jié)合并且抑制其轉(zhuǎn)錄活性。3.5 NF-κB對PDCD4和C-myc的表達改變由于NF-κB可以調(diào)控mi R-330-3p和mi R-26b的表達,我們推測其是否也可以影響miRNA靶基因的表達。分別采用過表達p65或抑制NF-κB活性的策略檢測NF-κB對PDCD4和C-myc蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在EC109和KYSE450細胞中,NF-κB對PDCD4的表達為負調(diào)控關(guān)系;此外,在兩種食管鱗癌細胞中NF-κB對C-myc表達的調(diào)控也表現(xiàn)為下調(diào)C-myc的蛋白水平。綜上所述,本課題主要從以下幾方面進行了研究:(1)通過檢測mi R-330-3p和mi R-26b在食管鱗癌腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達,試圖闡明這兩個mi RNAs在食管鱗癌中的表達特性。(2)采用過表達或干擾手段,經(jīng)體內(nèi)、體外實驗,明確mi R-330-3p和mi R-26b對食管鱗癌細胞的生物學行為的影響,并且鑒定了它們可能發(fā)揮作用的潛在下游靶基因。(3)初步探討了食管鱗癌細胞中mi R-330-3p和miR-26b的表達調(diào)控機制,發(fā)現(xiàn)其可能參與了NF-κB的調(diào)控通路�？傊�,本課題主要以探索mi R-330-3p和mi R-26b在食管鱗癌中的表達與功能為目標,借助miRNAs可以調(diào)控多個靶基因,而其本身表達又可受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的特點,進一步對參與miRNAs發(fā)揮功能作用的上、下游調(diào)控機制展開了科學研究。本研究有助于理清“NF-κB—miRNAs—靶基因”參與食管鱗癌細胞生長的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為進一步揭示mi RNAs的分子功能及食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制提供新的線索。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.1
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 miR3303p在食管鱗癌中的功能及其調(diào)控機制探討
    2.1 材料與方法
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 miR-26b在食管鱗癌中的功能及其調(diào)控機制探討
    3.1 材料與方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 NF-κB調(diào)控mi RNAs參與抑制食管鱗癌細胞生長的機制研究
    4.1 材料與方法
    4.2 結(jié)果
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
攻博期間其他研究
文獻綜述 食管鱗癌的表觀遺傳學研究進展
    參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
致謝

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Plasma DNA methylation of Wnt antagonists predicts recurrence of esophageal squamous cell carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2011年44期

本文編號：2844079