目的:探究IL-11在非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma NSCLC)進(jìn)展中的作用以及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法:(1)構(gòu)建敲低以及過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,利用平板克隆、增殖曲線、Brd U摻入實(shí)驗(yàn)分析敲低IL-11或過表達(dá)IL-11后對細(xì)胞增殖的影響;在過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,加入Ig G或IL-11中和抗體后,分析阻斷IL-11后細(xì)胞增殖能力的改變。(2)將用scramble或sh IL11-1處理的A549細(xì)胞注射到雌性裸鼠的右側(cè)背部,探究IL-11對體內(nèi)成瘤的影響。(3)在敲低以及過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,利用遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)分析敲低IL-11或過表達(dá)IL-11對細(xì)胞遷移以及侵襲能力的影響;在過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,加入Ig G或IL-11中和抗體后,分析阻斷IL-11后對細(xì)胞遷移以及侵襲能力的影響。(4)將用scramble或sh IL11-1處理的A549細(xì)胞注射到雌性裸鼠尾靜脈,觀察并記錄小鼠肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的發(fā)生以及小鼠生存周期。(5)在敲低IL-11的A549細(xì)胞系中,采用免疫熒光方法檢測EMT標(biāo)志物的改變;在敲低IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,檢測細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平;在過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,加入Ig G或IL-11中和抗體后,分析阻斷IL-11后對細(xì)胞中EMT標(biāo)志物表達(dá)水平的影響。(6)在敲低IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,采用WB方法檢測IL-11是否參與STAT3和AKT信號途徑,同時采用免疫組化方法檢測小鼠皮下異種移植腫瘤中活化的STAT3的表達(dá)水平。(7)探究NSCLC細(xì)胞在常氧與缺氧條件下HIF-1α,IL-11的表達(dá)水平;在常氧條件下,加入HIF-1α降解阻斷劑后檢測IL-11的表達(dá)水平。(8)通過q RT-PCR分析18個NSCLC患者的肺癌樣品和5個正常肺樣品中的IL-11表達(dá)水平,并分析在線數(shù)據(jù)庫中IL-11的表達(dá)水平與患者的預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建敲低以及過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,敲低IL-11后抑制NSCLC細(xì)胞的增殖能力,而過表達(dá)IL-11后可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的增殖能力,同時加入IL-11的中和抗體可逆轉(zhuǎn)IL-11誘導(dǎo)增強(qiáng)的增殖能力。(2)在小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中,與注射對照組細(xì)胞的小鼠相比,注射敲低IL-11細(xì)胞組的小鼠皮下成瘤能力顯著下降。(3)在敲低以及過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,敲低IL-11后抑制NSCLC細(xì)胞的遷移與增殖能力,而過表達(dá)IL-11后可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的遷移與侵襲能力,同時加入IL-11的中和抗體可逆轉(zhuǎn)IL-11誘導(dǎo)增強(qiáng)的遷移與侵襲能力。(4)在小鼠肺部轉(zhuǎn)移模型中,與注射對照組細(xì)胞的小鼠相比,注射敲低IL-11細(xì)胞組的小鼠肺部轉(zhuǎn)移能力明顯降低。(5)細(xì)胞免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白、ZO-1蛋白在敲低IL-11的A549細(xì)胞中表達(dá)增高,相反,間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白的表達(dá)受到抑制;同時WB結(jié)果顯示,敲低IL-11后可上調(diào)E-鈣粘蛋白,緊密連接蛋白-1和ZO-1表達(dá),同時抑制波形蛋白和N-鈣粘著蛋白的表達(dá),過表達(dá)IL-11可得到相反的結(jié)果;在過表達(dá)IL-11的A549及H1299細(xì)胞系,加入Ig G或IL-11中和抗體后,可逆轉(zhuǎn)IL-11誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生。(6)STAT3和AKT信號途徑分析,IL-11可激活NSCLC中STAT3和AKT信號途徑;同時與對照組小鼠相比,敲低IL-11可抑制小鼠皮下異種移植腫瘤中STAT3的表達(dá)。(7)與常氧條件相比,NSCLC在缺氧條件下HIF-1α,IL-11的表達(dá)水平明顯增高;在常氧條件下,加入HIF-1α阻斷劑后IL-11的表達(dá)水平明顯增高,表明缺氧通過HIF-1α誘導(dǎo)NSCLC中IL-11表達(dá)增高。(8)腫瘤樣品中的IL-11表達(dá)水平顯著高于正常肺樣品;此外,來自在線數(shù)據(jù)庫的公開數(shù)據(jù)顯示IL-11的高表達(dá)水平與患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,IL-11可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲;IL-11參與缺氧反應(yīng)和EMT;IL-11在NSCLC患者中表達(dá)上調(diào)并與患者不良預(yù)后相關(guān);闡明IL-11促進(jìn)NSCLC進(jìn)展機(jī)制可為NSCLC的治療提供新的研究方向。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

圖 1.1：A: 用 shIL11-1，shIL11-2 或 scramble shRNA 感染 A549 和 H1299 細(xì)胞后檢測 IL-11mRNA 水平；B: 用 shIL11-1，shIL11-2 或 scrambleshRNA 感染 A549和 H1299 細(xì)胞后，檢測細(xì)胞上清中 IL-11 的水平。*, P<0.05, * *,P<0.01。1.2.2 敲低 IL-11 抑制 NSCLC 細(xì)胞增殖我們檢測了敲低 IL-11 對 A549 和 H1299 細(xì)胞增殖的影響。首先，我們進(jìn)行集落形成測定，與對照細(xì)胞組相比，敲低 IL-11 后可抑制細(xì)胞集落形成（圖 C 和D）。為了進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)行了 A549 和 H1299 細(xì)胞的細(xì)胞增殖曲線檢測，如圖 E-F 所示，與對照組相比，敲低 IL-11 后，A549 細(xì)胞和 H1299 細(xì)胞表現(xiàn)出增殖抑制。胸苷類似物 BrdU（5-溴-2'-脫氧尿苷）可以在分裂過程中自然并入增殖細(xì)胞的 DNA 中，我們檢測了敲低 IL-11 是否影響 BrdU 摻入，如圖G 所示，敲低 IL-11 可顯著抑制 A549 和 H1299 細(xì)胞中的 BrdU 摻入。

圖 1.2C: 集落形成實(shí)驗(yàn)中 A549 細(xì)胞代表性形成集落。D:A549 和 H1299 細(xì)胞對照組，shIL11-1 組和 shIL11-2 組集落形成數(shù)。E-F: 通過 MTS 測定 A549 和 H1299細(xì)胞對照組，shIL11-1 組和 shIL11-2 組的增殖曲線。G:A549 和 H1299 細(xì)胞對照組，shIL11-1 組和 shIL11-2 組 BrdU 摻入測定結(jié)果。*, P<0.05, * *, P<0.01。1.2.3 NSCLC 細(xì)胞過表達(dá) IL-11 效率驗(yàn)證為了進(jìn)一步證實(shí) IL-11 促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞增殖，在 A549 和 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) IL-11。qRT-qPCR 和 ELISA 實(shí)驗(yàn)證實(shí) IL-11 過表達(dá)成功。（圖 H-I）。

圖 1.3 H:用空載體質(zhì)�；蜻^表達(dá)質(zhì)粒在 A549 和 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) IL-11 后檢測細(xì)胞中 IL-11mRNA 水平；I: 用空載體質(zhì)粒或過表達(dá)質(zhì)粒在 A549 和 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) IL-11 后檢測細(xì)胞上清液中 IL-11 濃度。*, P<0.05, * *,P<0.01。1.2.4 過表達(dá) IL-11 促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞增殖與對照組相比，A549 和 H1299 細(xì)胞過表達(dá) IL-11 后形成的細(xì)胞集落增多（圖J 和 K），并且細(xì)胞增殖率也明顯增大（圖 L 和 M）。此外，過表達(dá) IL-11 可增強(qiáng)A549 和 H1299 細(xì)胞中的 BrdU 摻入（圖 N）。然而，當(dāng)加入 IL-11 中和抗體時，IL-11 誘導(dǎo)增強(qiáng)的增殖能力受到顯著抑制（圖 J-N）。并且，IL-11 以劑量依賴性方式增強(qiáng) A549 與 H1299 細(xì)胞中的 BrdU 摻入（圖 O）。
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本文編號：2843406