研究背景:胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,據(jù)最新研究報道,我國每年胃癌新發(fā)病人數(shù)為697,000例,胃癌相關(guān)死亡人數(shù)為499,000例[1]。從世界范圍來看,我國每年胃癌發(fā)率和死亡率均為世界平均水平的2倍多,且絕對數(shù)量位居世界首位[2]。目前,根治性手術(shù)聯(lián)合輔助化療的綜合治療方案是臨床上治療胃癌的常規(guī)方法,且手術(shù)仍然是可能治愈胃癌的唯一手段。但由于我國醫(yī)療條件和普查意識的不足,大多數(shù)患者(80-90%)在首次診斷時已經(jīng)發(fā)展至進(jìn)展期胃癌,術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率偏高,甚至部分患者在首次明確診斷時已經(jīng)無法進(jìn)行根治性手術(shù)[3,4]。對于接受了根治性手術(shù)或有效放化療的進(jìn)展期胃癌患者,五年生存率仍不理想(40%)[5]�；谏鲜銮闆r,深入探究胃癌的生物學(xué)特性,尋找胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及化療耐藥的相關(guān)基因,對進(jìn)一步提高胃癌綜合療效,改善胃癌患者近期和遠(yuǎn)期預(yù)后具有重大意義。研究表明,LIN28B是一個與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因。在人類基因組中,LIN28B定位于6q21染色體,基因編碼區(qū)含有25 0個氨基酸殘基,與其同源的LIN28A序列高度相似,相似度達(dá)76%[6]。LIN28B所編碼的蛋白屬于一種高度保守的小RNA結(jié)合蛋白,具有將人類成纖維細(xì)胞重新編碼為多能干細(xì)胞的能力,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、新陳代謝以及多能性方面起到極為重要的作用[7]。LIN28B蛋白在干細(xì)胞組織和胚胎組織中存在高表達(dá),隨著組織細(xì)胞的不斷分化成熟,其表達(dá)隨之降低,但在部分人類惡性腫瘤組織中出現(xiàn)反常高表達(dá)現(xiàn)象,并在維持腫瘤干細(xì)胞“干性”方面起著重要作用[8,9],故其被認(rèn)為是“癌胚基因”。國內(nèi)外研究提示,LIN28B主要通過let-7 micro RNA的雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。mi RNA是最近幾年來基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn),是非編碼RNA家族中的一支,屬于非編碼單鏈RNA分子,能夠在轉(zhuǎn)錄后抑制靶標(biāo)m RNA的翻譯甚至降解其翻譯產(chǎn)物,從而實現(xiàn)基因沉默的關(guān)鍵作用;在與靶基因的m RNA結(jié)合之后,對細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡和應(yīng)激方面都會產(chǎn)生極為重要的影響。研究發(fā)現(xiàn),mi RNA的調(diào)控失調(diào)是惡性腫瘤發(fā)生的重要因素之一,常在惡性腫瘤中出現(xiàn)低表達(dá)特征[10,11]。LIN28B可通過雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路來抑制let-7 mi RNA家族轉(zhuǎn)錄后的成熟,從而實現(xiàn)其促癌作用。研究人員于1993年首次在人基因組中發(fā)現(xiàn)let-7,其屬于非編碼micro RNA中的重要家族之一,在維持人體胚胎干細(xì)胞分化和可塑性狀態(tài)方面起到極為重要的作用[10,12]。另一方面,越來越多的實驗表明,LIN28B在腫瘤干細(xì)胞形成中起到重要作用,是腫瘤干細(xì)胞重要的表面分子標(biāo)志物[13]。它不僅可以促進(jìn)纖維母細(xì)胞重新編碼為多能干細(xì)胞,而且還可維持腫瘤中“干樣”細(xì)胞的穩(wěn)定性。綜上,LIN28B非�？赡軈⑴c了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。此外,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。最新研究結(jié)果表明,在胃癌中LIN28B的高表達(dá)與胃癌的復(fù)發(fā)相關(guān)。此外,輔助化療是胃癌綜合治療的重要一環(huán),奧沙利鉑作為最常用的一線用藥在但臨床上耐藥現(xiàn)象較為普遍,嚴(yán)重影響了胃癌化療效果。因此,研究該耐藥現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制可能有利于提高化療效果,降低胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后。第一部分:LIN28B在胃癌組織中的表達(dá)量及其與胃癌患者臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性分析目的:選取250例病歷資料完整的胃癌患者,進(jìn)行LIN28B表達(dá)水平的回顧性分析,以明確LIN28B在胃癌腫瘤組織中表達(dá)水平與病理、腫瘤分期、分化以及長期預(yù)后的關(guān)系。方法:1)選取2005年-2012年,250名病歷資料完整及術(shù)后大體標(biāo)本保持完好的胃癌患者,其中100例來自于解放軍南京總院,150例來源于西京醫(yī)院消化外科;2)病理組織HE染色和免疫組化染色;3)對免疫組化染色進(jìn)行半定量分析并分級;4)LIN28B表達(dá)水平與胃癌患者一般資料相關(guān)性,采用χ2和t檢驗進(jìn)行分析;Kaplan-Meier生存曲線分析胃癌患者預(yù)后,單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。結(jié)果:1)胃癌組織中LIN28B蛋白低水平表達(dá)患者為96例(38.4%),高表達(dá)患者154例(61.6%);2)腫瘤分化程度與相應(yīng)組織中LIN28B的蛋白表達(dá)含量有明顯相關(guān)性(P=0.001);LIN28B蛋白表達(dá)量越高腫瘤分化越差,相反高中分化的胃癌組織中LIN28B蛋白表達(dá)含量低;3)LIN28B蛋白低表達(dá)胃癌病人5年生存率及中位生存時間明顯優(yōu)于高表達(dá)患者(76%vs.41.2%,P0.01);4)多因素分析發(fā)現(xiàn),LIN28B蛋白表達(dá)量和臨床N分期(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)是獨(dú)立危險因素,可以作為預(yù)測因子。結(jié)論:胃癌組織中LIN28B表達(dá)含量與腫瘤分化情況有關(guān),但與腫瘤大小、浸潤程度無關(guān);LIN28B表達(dá)量越高患者預(yù)后越差;LIN28B表達(dá)量和臨床N分期都是預(yù)后的獨(dú)立危險因素,可提示患者預(yù)后不良。第二部分:LIN28B在胃癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)量及其與胃癌新輔助化療后病理反應(yīng)的相關(guān)性目的:比較LIN28B在癌旁正常組織與胃癌組織中表達(dá)含量的差別,并闡明LIN28B蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)含量對新輔助化療療效的影響,及新輔助化療前后胃癌組織中LIN28B含量的變化。方法:1)選取南京總院2015-2017年新近診斷的進(jìn)展期胃癌患者共24名;2)新輔助化療前行全腹部增強(qiáng)CT檢查,進(jìn)行臨床評估,而后行胃鏡檢查獲取胃癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本;3)所有患者完成2周期新輔助化療(XELOX)后復(fù)查增強(qiáng)CT,進(jìn)行化療后評估,然后行D2根治手術(shù);4)化療療效臨床評估采用RECIST實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[14],胃癌化療病理評估根據(jù)Becker標(biāo)準(zhǔn)[15];5)通過RT-PCR及免疫組化技術(shù)檢測LIN28B RNA及蛋白表達(dá)量;6)采用Fisher檢驗統(tǒng)計分析新輔助化療后臨床、病理療效與LIN28B表達(dá)量關(guān)系,以及LIN28B在新輔助化療前后表達(dá)量變化;同時利用配對t檢驗統(tǒng)計分析腫瘤組織與癌旁對應(yīng)正常組織間LIN28B表達(dá)量的差異。結(jié)果:1)LIN28B表達(dá)量與化療臨床療效評估結(jié)果無關(guān)(P=0.432),LIN28B低表達(dá)組患者共11例(PR 5例,SD5例,PD1例),高表達(dá)組患者共13例(PR 7例,SD3例,PD3例);2)LIN28B表達(dá)量與新輔助化療后病理反應(yīng)具有相關(guān)性(P=0.006),LIN28B低表達(dá)組11例(1a級2例,1b-2級8例,3級1例),高表達(dá)組13例(1a級0例,1b-2級5例,3級8例);3)新輔助化療前LIN28B低表達(dá)組為9例,高表達(dá)為13例,新輔助化療后低表達(dá)組減少到5例,高表達(dá)組增加到17例,化療前后變化具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002);4)LIN28B的表達(dá)量在胃癌組織中要高于相應(yīng)癌旁正常組織(3.87±0.35 vs.1.95±0.20,P0.01)。結(jié)論:癌旁正常組織中LIN28B表達(dá)量要明顯低于胃癌組織;新輔助化療前胃癌組織中的LIN28B表達(dá)量與化療病理反應(yīng)有顯著相關(guān)性,但與臨床評估結(jié)果無關(guān),即LIN28B表達(dá)量越高,新輔助化療病理反應(yīng)越差,故其可作為新輔助化療療效的預(yù)測指標(biāo);新輔助化療后LIN28B表達(dá)量有所升高,其中原因之一可能是由于表達(dá)陽性的胃癌細(xì)胞易出現(xiàn)化療耐藥,而陰性表達(dá)細(xì)胞對化療敏感被殺滅,從而導(dǎo)致陽性表達(dá)細(xì)胞比例升高所致。第三部分:建立穩(wěn)定表達(dá)LIN28B的胃癌細(xì)胞系并對表達(dá)LIN28B的胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及化療耐藥進(jìn)行體外研究目的:創(chuàng)建持續(xù)表達(dá)LIN28B的胃癌細(xì)胞系,探討LIN28B的過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及化療耐藥的影響。方法:1)選取胃癌細(xì)胞系(SGC7901、SGC823及MKN45),采用RT-PCR及WB方法檢測LIN28B RAN及蛋白表達(dá)含量,選擇蛋白表達(dá)陰性的SGC7901細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗;2)使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pc DNA3.1+-LIN28B以及pc DNA3.1+作為空白對照,然后利用RT-PCR和WB技術(shù)檢測LIN28B表達(dá)水平;3)采用MTT、細(xì)胞克隆形成實驗、腫瘤侵襲實驗、化療敏感性實驗(奧沙利鉑)對比轉(zhuǎn)染后兩株細(xì)胞特性;4)采用si RNA干擾技術(shù),敲低高表達(dá)細(xì)胞株的LIN28B表達(dá)量,然后再次通過上述實驗明確LIN28B的影響;5)采用t檢驗及方差分析比較各組間差異。結(jié)果:1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,SGC7901-LIN28B細(xì)胞株的LIN28B的RNA和蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照(P0.01);2)MTT及細(xì)胞克隆形成實驗提示SGC7901-LIN28B細(xì)胞株細(xì)胞增殖要明顯高于空白對照(P0.05);3)腫瘤侵襲實驗表明穩(wěn)定表達(dá)LIN28B的SGC7901-LIN28B細(xì)胞株的侵襲能力明顯增加(P0.01),同時化療耐藥性增高(P0.05);4)經(jīng)過si RNA干擾后,高表達(dá)細(xì)胞的LIN28B表達(dá)含量降低,其增殖能力、侵襲性和化療耐藥性相應(yīng)的出現(xiàn)下降。結(jié)論:轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞LIN28B RNA及蛋白表達(dá)量升高,細(xì)胞活力和增殖能力明顯增強(qiáng),對化療(奧沙利鉑)耐藥性增強(qiáng),提示LIN28B的高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移,并增加其耐藥性,與促進(jìn)胃癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥明顯相關(guān),從而進(jìn)一步影響胃癌患者預(yù)后。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

-49-圖 1.LIN28B 高表達(dá)組與低表達(dá)組生存比較LIN28B 高表達(dá)組（紅色，N=154）5 年生存率為 41.2%，中位生存時間為 30 個月；LIN28B 表達(dá)組（藍(lán)色，N=96）5 年生存率為 76%，中位生存時間為 65.3 個月，兩組相比具有統(tǒng)計學(xué)異（P＜0.01）。

-74- 3 使用 RT-PCR 技術(shù)檢測 LIN28B RNA 在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)水24 名患者接受新輔助化療前的胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織 LIN28B RNA 表達(dá)水GC 胃癌組織，GN 癌旁正常組織）；（B）配對 t 檢驗比較胃癌組織和正常組織 LI表達(dá)量（1.93±0.120 vs. 3.75±0.207, **P＜0.01）。

圖 4 LIN28B 蛋白在胃癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較（A）正常組織中 LIN28B 蛋白低表達(dá)（×400）；（B）部分胃癌組織中 LIN28B 蛋白低表達(dá)（×400）；（C，D）LIN28B 在胃癌組織中高表達(dá)（×100，×400）；（E，F(xiàn)）采用 WB 檢測 12 例LIN28B 蛋白在胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織表達(dá)水平比較（注：GC 胃癌組織，GN 癌旁正常組織）；（4.29±0.928 vs. 1.65±0.387，**P＜0.01）。
【參考文獻(xiàn)】

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1 胡祥;;日本《胃癌治療指南》(第3版)解讀[J];中國實用外科雜志;2010年01期

2 陳寶敏;董軍;沈云天;王中勇;宋武超;黃強(qiáng);蘭青;;人腦膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞系SU-2放射耐受及其相關(guān)機(jī)制的初步研究[J];中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2008年05期

3 張淑群,強(qiáng)水云,楊文彬,姜建濤,紀(jì)宗正;Survivin蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的表達(dá)及意義[J];癌癥;2004年06期

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