胰腺癌是全球發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一,根據(jù)我國國家癌癥中心2015年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,胰腺癌在惡性腫瘤病死率中排名前10,在大城市人群中排名還要更高,胰腺癌術(shù)后5年生存率6%。現(xiàn)今,手術(shù)切除仍然是唯一可能治愈胰腺癌的手段,但就診時僅有小部分胰腺癌患者為可切除病灶。且胰腺癌轉(zhuǎn)移傾向明顯,即使影像學(xué)檢查無相關(guān)提示,但微轉(zhuǎn)移灶往往已經(jīng)存在,導(dǎo)致R0切除難以實現(xiàn),術(shù)后復(fù)發(fā)率在85%以上。胰腺癌對化療藥物吉西他濱等易耐藥,生物藥物方面雖有Ras等明確促進胰腺癌發(fā)生發(fā)展的基因被發(fā)現(xiàn),但分子靶向藥物難以獲得或效果欠佳。30年來,胰腺癌患者術(shù)后中位生存期無明顯改善。所以,胰腺癌的診治關(guān)鍵在于積極尋找改善胰腺癌化療藥物耐藥的分子及新型生物靶向作用分子為胰腺癌的化療及生物治療提供更多可能。組氨酸三聯(lián)體核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性,屬于組氨酸三聯(lián)體蛋白超家族,該家族成員蛋白廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡通路及DNA、RNA和碳水化合物代謝過程。HINT2在早期報道中發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞線粒體中,主要存在于哺乳動物的肝臟、胰腺和腎上腺器官中,并發(fā)現(xiàn)在肝癌中低表達,進一步研究證明其增加肝癌細(xì)胞凋亡敏感性,提示HINT2在胰腺癌中的可能也發(fā)揮著重要的作用。第一部分組氨酸三聯(lián)體核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)在胰腺癌中具有抑癌作用目的:通過實驗證實HINT2在胰腺癌中的抑癌作用及探討其可能機制。方法:通過免疫組化染色對180個胰腺癌癌組織與癌旁組織樣本中HINT2的表達量進行測定并通過與臨床資料的結(jié)合進行統(tǒng)計分析,確定HINT2表達量與胰腺癌發(fā)生發(fā)展及患者生存預(yù)后關(guān)系。而后,在胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3及L3.6pl中運用腺病毒載體進行HINT2過表達。分別通過流式熒光測定、CCK8實驗、劃痕實驗及Transwell實驗確定過表達HINT2之后細(xì)胞的周期、凋亡、增殖及侵襲遷移細(xì)胞功能學(xué)變化,并用Western Blot確定相關(guān)蛋白變化。再用HINT2過表達慢病毒載體進行胰腺癌細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,而后進行集落形成實驗及裸鼠皮下成瘤實驗確定HINT2對胰腺癌腫瘤細(xì)胞生長能力及體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,胰腺癌和癌旁標(biāo)本中HINT2表達量存在顯著性差異(P0.001),胰腺癌組織中的HINT2表達水平顯著低于癌旁組織。經(jīng)生存曲線分析高表達HINT2組生存時間明顯長于低表達組(P0.05)。經(jīng)過對胰腺癌組織臨床資料的整合分析,HINT2表達水平還與胰腺癌的病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P0.05)。在BxPC-3和L3.6pl兩種細(xì)胞系中,過表達HINT2的實驗組細(xì)胞比對照組細(xì)胞凋亡增加(P0.05),周期G2期細(xì)胞增加(P0.05),實驗組中侵襲及遷移過中文生物膜的細(xì)胞均比對照組顯著減少(P0.05);CCK8結(jié)果顯示,實驗組吸光度值顯著低于對照組(P0.05),實驗組集落形成減少,裸鼠成瘤體檢顯著小于對照組(P0.05)。結(jié)論:HINT2在胰腺癌組織中表達顯著低于癌旁組織,與患者生存期長短相關(guān),且與病理分級和淋巴轉(zhuǎn)移有聯(lián)系。過表達HINT2胰腺癌細(xì)胞系相比于對照組在細(xì)胞功能學(xué)和裸鼠成瘤實驗中均展現(xiàn)出了抑制癌癥發(fā)生發(fā)展的結(jié)果。第二部分組氨酸三聯(lián)體核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)通過與線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體(MCU)相互作用促進胰腺癌細(xì)胞凋亡目的:通過實驗證明HINT2通過與線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體(MCU)的相互作用從而引起線粒體內(nèi)鈣離子超載,最終導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的凋亡。方法:通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3,使細(xì)胞系過表達HINT2。將HINT2過表達細(xì)胞用釕紅(Ruthenium Red,RR)處理24-48小時后以達到阻滯線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體(MCU)的目的。后通過AnnexinV/PI凋亡試劑,活性氧(ROS)檢測試劑及線粒體膜電位JC-1試劑進行對照組、HINT2過表達組及RR組的細(xì)胞處理,流式細(xì)胞儀探測熒光值。用Rhod-2 AM染料特異性染胰腺癌線粒體內(nèi)鈣離子,流式細(xì)胞儀探測熒光值。Western Blot技術(shù)確定MCU復(fù)合體相關(guān)蛋白變化。結(jié)果:過表達HINT2的細(xì)胞相比與對照組凋亡細(xì)胞明顯增多,活性氧水平(ROS)升高,線粒體膜電位(△ψm)下降(P0.05)。但是經(jīng)過線粒體鈣離子通道阻滯劑釕紅(RR)處理后,凋亡細(xì)胞增多、ROS水平升高及線粒體膜電位(Aψm)下降趨勢均被抑制。Western Blot結(jié)果顯示,過表達HINT2后MCU復(fù)合體中門控分子MICU1及MICU2表達均顯著下降,EMRE有所升高。經(jīng)過Rhod-2AM特異性染色處理顯示,過表達HINT2細(xì)胞線粒體鈣離子含量顯著升高,并且合用吉西他濱(Gemcitabine)后有進一步升高趨勢,但是線粒體鈣離子濃度可被紅(RR)處理抑制。結(jié)論:本研究表明,HINT2通過影響線粒體鈣離子單項轉(zhuǎn)運體(MCU)復(fù)合體的門控分子,使線粒體內(nèi)鈣離子超載,從而引起線粒體膜電位下降,ROS升高,誘導(dǎo)了胰腺癌細(xì)胞的線粒體途徑凋亡。第三部分組氨酸三聯(lián)體核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)與吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用目的:通過實驗證明HINT2與吉西他濱共同作用于胰腺癌細(xì)胞具有凋亡協(xié)同效應(yīng)。方法:將BxPC-3細(xì)胞分為4組,分別用對照病毒及HINT2過表達腺病毒進行轉(zhuǎn)染后,再分別用PBS及1μM鹽酸吉西他濱處理2448小時。通過Annexin V/PI凋亡試劑經(jīng)流式細(xì)胞儀探測熒光值確定細(xì)胞凋亡率。將BxPC-3細(xì)胞接種于96孔板中,分別用對照病毒及HINT2過表達腺病毒處理后,加入不同濃度鹽酸吉西他濱24小時后進行CCK-8檢測,通過數(shù)據(jù)處理得出量效曲線及IC50值。Western Blot技術(shù)確定腺病毒轉(zhuǎn)染及經(jīng)過鹽酸吉西他濱處理后HINT2及凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果:HINT2與吉西他濱聯(lián)合作用于胰腺癌細(xì)胞,使胰腺癌細(xì)胞凋亡率增加并且多于單因素作用,表明兩者對于胰腺癌細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用。HINT2過表達組相比于對照組吉西他濱處理后的IC50有顯著降低,表明HINT2可以增加胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的藥物敏感性。Western Blot結(jié)果顯示過表達腺病毒處理后HINT2有所增加,并且加用吉西他濱處理后,HINT2表達量進一步上升,凋亡相關(guān)蛋白在單用過表達腺病毒處理組及吉西他濱處理組均有明顯升高,兩者聯(lián)用升高趨勢更加明顯。結(jié)論:本實驗結(jié)果表明,HINT2與吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用,并且吉西他濱可以增加細(xì)胞內(nèi)HINT2表達量,HINT2可以增加細(xì)胞對吉西他濱藥物敏感性。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.9
【部分圖文】：

為了確定組織芯片中１８０例胰腺癌和癌旁組織中的ＨＩＮＴ２含量，我們團隊運用??ＨＥ染色，特異性ＨＩＮＴ２—抗和免疫組化染色技術(shù)，將組織標(biāo)本進行染色。觀察到??ＨＩＮＴ２在胰腺癌中的染色強度明顯弱于癌旁組織（圖１－１）。為了進一步進行統(tǒng)計??分析，我們運用打分方式將ＨＩＮＴ２的染色強弱進行量化，０－２分為低表達ＨＩＮＴ２，??＞２分為高表達ＨＩＮＴ２組，進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織的ＨＩＮＴ２低表達的例數(shù)要明顯??高于癌旁俎織（尸＜０．００１）（表１－３）。??Ａｄｊａｃｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ＰＤＡＣ??圖１－１組織芯片ＨＥ染色及免疫組化染色。染色結(jié)果顯示胰腺癌組織ＨＩＮＴ２表??達低于癌旁組織。（標(biāo)尺表示２５０ｕｍ長度，右下角為原圖片基礎(chǔ)上４倍放大）??２０??

量和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理分級相關(guān)，Ｐ值分別為０．０１０８和０．０１６１?（表１－４）。聯(lián)合患??者生存時間繪制Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線，發(fā)現(xiàn)ＨＩＮＴ２的表達量和胰腺癌患者生存預(yù)??后相關(guān)，ＨＩＮＴ２表達低的患者預(yù)后相對較差（圖１－２）。??表１＞４胰腺癌ＨＩＮＴ２表達量和臨床病理表現(xiàn)關(guān)系??Ｖａｒｉａｂｌｅ?ＨＩＮＴ２?Ｓｔａｉｎｉｎｇ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ?Ｐ?ｖａｌｕｅ??ｎｕｍｂｅｒ?Ｌｏｗ?Ｈｉｇｈ??Ｉｎ?ｇｅｎｅｒａｌ??Ｔｕｍｏｕｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?１００?７２?２８??Ｇｅｎｄｅｒ??Ｍａｌｅ?６３?４７?１６?０．４４９３??Ｆｅｍａｌｅ?３７?２５?１２??Ａｇｅ??＞６５?３７?２５?１２?０．４４９３??＜６５?６３?４７?１６??Ｔｕｍｏｕｒ?ｓｉｚｅ??＜２?ｃｍ?４?２?２?０．３１１８??＞２?ｃｍ?９６?７０?２６??Ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ??Ｙｅｓ?４０?３３?７?０．０５６２??２１??

為了明確ＨＩＮＴ２在胰腺癌中的作用，將ＢｘＰＣ－３和Ｌ３．６ｐｌ兩個細(xì)胞系進行ＨＩＮＴ２??過表達腺病毒的轉(zhuǎn)染，ＭＯＩ值為１００，轉(zhuǎn)染７２小時后換液，之后提取蛋白進行ＷＢ??實驗發(fā)現(xiàn)過表達組ＨＩＮＴ２的蛋白表達水平約為對照組１０倍（圖１－３）。??ＢｘＰＣ－３?Ｌ３．６ｐｌ??ＡＤ－ＮＣ?ＡＤ－ＨＩＮＴ２?ＡＤ－ＮＣ?ＡＤ－ＨＩＮＴ２??３－ａｃｔｉｎ??ＨＩＮＴ２?ｍ＼??０．１３?１．２７?０．２４?２．２５??圖１－３?ＢｘＰＣ－３和Ｌ３．６ｐｌ兩個細(xì)胞系進行ＨＩＮＴ２過表迖腺病毒的轉(zhuǎn)染后ＨＩＮＴ２??表迗量為對照組１０倍。??將轉(zhuǎn)染病毒后的細(xì)胞用Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ／ＰＩ試劑進行染色后用流式細(xì)胞儀檢測熒光??強度。Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ（＋）／ＰＩ（－）染色的細(xì)胞表示處于調(diào)亡早期的細(xì)胞，而Ａｎｎｅｘｉｎ??Ｖ（＋）／ＰＩ（＋）的細(xì)胞表示為凋亡晚期的細(xì)胞。在ＢｘＰＣ－３細(xì)胞中過表達組凋亡細(xì)胞??（Ｑ２＋Ｑ４區(qū)）要明顯多于對照組（對照組１９．９３±０．８６％ｖｓ．?ＨＩＮＴ２過表達組２８．０７??士?４．３１％，尸＜?０．０５）。在Ｌ３．６ｐｌ細(xì)胞系中也有相似結(jié)果（對照俎１３．４３?±?２．６１?％?ｖｓ．??ＨＩＮＴ２?過表達組?３１＿４７±４．６２％，尸＜０．０１）（圖?１－４Ａ－Ｂ）。??用周期試劑染色過表達病毒及對照病毒轉(zhuǎn)染后的ＢｘＰＣ－３細(xì)胞系，通過流式細(xì)??胞儀進行分析各個細(xì)胞周期所占細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，過表達ＨＩＮＴ２組Ｇ０／Ｇ１細(xì)??胞比對照組少，伴隨Ｇ２／Ｍ期細(xì)胞增多（Ｇ０／Ｇ１期對照組３４．８２±０．７３?％ｖｓ．?ＨＩＮＴ２??過表達組?２２．０８?±?０．７３％
【參考文獻】

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本文編號：2840532