【研究背景】膽囊癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今仍不明確。抑制凋亡是腫瘤細(xì)胞生存的關(guān)鍵因素,可使腫瘤在惡劣的微環(huán)境中生長和轉(zhuǎn)移。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一類高度保守的蛋白,因抑制細(xì)胞凋亡而得名,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前IAPs家族中研究最多的是Survivin,該家族另一重要成員c IAP2與腫瘤的關(guān)系研究甚少,與膽囊癌的關(guān)系更是未見相關(guān)報道。已知TNF-a與其受體結(jié)合后可募集RIP1、c IAP2等蛋白形成信號“復(fù)合體I”,通過該復(fù)合體啟動TNF-a致細(xì)胞生存或凋亡通路,RIP1泛素化是啟動細(xì)胞生存通路的重要因素。c IAP2作為“復(fù)合體I”成員,具有泛素酶活性,推測c IAP2通過泛素化修飾RIP1使TNF-a啟動了細(xì)胞生存通路,從而促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生發(fā)展。因此本課題擬探討c IAP2在膽囊癌生長轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控機(jī)制,研究結(jié)果有助于揭示膽囊癌發(fā)展機(jī)制�！痉椒ā�1、熒光PCR和免疫組化檢測臨床膽囊癌組織(GBC)c IAP2表達(dá),并分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。2、在GBC細(xì)胞NOZ中沉默或過表達(dá)c IAP2,應(yīng)用CCK8、劃痕實驗、Trsanwell小室、與HDLEC共培養(yǎng)實驗檢測c IAP2對NOZ細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。3、構(gòu)建裸鼠原位GBC,觀察c IAP2對裸鼠GBC生長及轉(zhuǎn)移的影響。4、雙熒光素酶報告基因、蛋白免疫印跡、免疫熒光及ELISA方法探索c IAP2與TNF-a-NF-κB(P65)和TNF-a-VEGF-C相關(guān)性。免疫共沉淀和免疫熒光定位驗證c IAP2與RIP1間的相互作用,并通過泛素突變體探索c IAP2靶向修飾RIP1的方式�！窘Y(jié)果】1.GBC組織中c IAP2表達(dá)與患者淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系c IAP2 m RNA和蛋白在GBC組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(m RNA:6.54±0.88 Vs 3.25±0.39,P0.05;蛋白:0.2854±0.0061 Vs 0.1722±0.0084,P0.05)。臨床病理參數(shù)分析:c IAP2的表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(X 2=13.227,P0.001);c IAP2高表達(dá)患者中位生存時間(18個月)顯著低于低表達(dá)者(34個月);c IAP2高表達(dá)患者2年總體生存率(16.7%)顯著低于低表達(dá)者(64.3%),P0.05。2、c IAP2對膽囊癌NOZ細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及淋巴管生成的影響成功構(gòu)建兩組c IAP2干擾細(xì)胞NOZ,分別為sic IAP2#1和sic IAP2#2,以及c IAP2高表達(dá)NOZ細(xì)胞。CCK8檢測:第60h檢測時,干擾c IAP2表達(dá)后sic IAP2#1組(0.840±0.028)和sic IAP2#2組(0.773±0.015)NOZ細(xì)胞的增殖能力較對照組(1.118±0.058)顯著下降;過表達(dá)c IAP2組(1.314±0.005)的NOZ細(xì)胞增殖能力顯著高于空載體組(1.001±0.002)。劃痕實驗:第24h檢測時,干擾c IAP2表達(dá)后sic IAP2#1組(38.67±1.20%)和sic IAP2#2組(40.00±2.08%)NOZ細(xì)胞的遷移能力較對照組(56.67±2.40%)顯著下降;過表達(dá)c IAP2組(84.67±2.60%)的NOZ細(xì)胞遷移能力顯著高于空載體組(55.0±2.08%)。Transwell小室:干擾c IAP2表達(dá)后sic IAP2#1組(148±8.32)和sic IAP2#2組(154.7±8.37)NOZ細(xì)胞的侵襲能力顯著低于對照組(290.3±11.83);過表達(dá)c IAP2組(376.3±7.84)的細(xì)胞侵襲能力相對空載體組(257.3±9.26)顯著升高。膽囊癌NOZ細(xì)胞與HDLEC共培養(yǎng):干擾c IAP2表達(dá)后sic IAP2#1組(11.0±0.58)和sic IAP2#2組(11.33±1.86)細(xì)胞的淋巴成管能力較對照組(18.67±1.76)明顯下降;過表達(dá)c IAP2組(27.33±0.88)的細(xì)胞淋巴成管能力相對空載體組(17.67±1.45)顯著升高。3、c IAP2對裸鼠GBC的形成、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微淋巴管形成的影響接種干擾c IAP2組細(xì)胞(sic IAP2#1)與對照組比較,裸鼠GBC平均重量降低(1.074±0.160g Vs 1.701±0.228g,P=0.0405)、腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的平均數(shù)量減少(2.250±1.11 Vs 7.125±1.977,P=0.0497)、GBC淋巴管密度降低(5.625±1.668 Vs11.88±2.781,P=0.0436);接種過表達(dá)c IAP2組與空載對照組細(xì)胞比較,裸鼠的GBC平均重量增加(2.544±0.298g Vs 1.689±0.239g,P=0.0421)、裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)平均數(shù)量增加(18.750±4.843 Vs7.000+1.982,P=0.0414)、GBC淋巴管密度增高(17.75±1.509 Vs 11.50±2.22,P=0.0354)。4、c IAP2對TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB和VEGF-C活性的影響,以及對RIP1的泛素化修飾雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TNF-a刺激不同組NOZ細(xì)胞后NF-κB(P65)的活性,結(jié)果顯示c IAP2干擾組:sic IAP2#1組(0.553±0.069)和sic IAP2#2組(0.637±0.067))的NF-κB(P65)的活性顯著低于干擾對照組(1.157±0.069);c IAP2過表達(dá)組(1.413±0.147)的NF-κB(P65)的活性顯著高于對照空載組(0.930±0.073)。Westren blot和細(xì)胞免疫熒光檢測NF-κB核轉(zhuǎn)移情況,干擾c IAP2表達(dá)后,TNF-a刺激引起NOZ細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)移減少;過表達(dá)c IAP2,TNF-a刺激引起NOZ細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)移增加。ELISA檢測c IAP2對VEGF-C活性的影響,c IAP2干擾組:sic IAP2#1組(44.67±3.71)和sic IAP2#2組(52.67±3.93)的VEGF-C的活性顯著低于干擾對照組(95.33±4.91);c IAP2過表達(dá)組(148.0±6.81)的VEGF-C的活性顯著高于對照空載組(84.67±4.81)。免疫共沉淀和熒光共定位實驗結(jié)果顯示在NOZ細(xì)胞內(nèi)c IAP2可結(jié)合RIP1,并通過K63位點對RIP1進(jìn)行多聚泛素化修飾�！窘Y(jié)論】1、c IAP2在人GBC組織中表達(dá)增高,并與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。2、c IAP2可促進(jìn)GBC細(xì)胞增殖、侵襲和淋巴管形成,從而促進(jìn)GBC生長、微淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。3、c IAP2可增強(qiáng)TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB(P65)和VEGF-C表達(dá)。4、c IAP2可與RIP1結(jié)合,并通過K63位點對RIP1進(jìn)行多聚泛素化修飾。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

圖 1-1 qRT-PCR 檢測膽囊癌及癌旁組織 cIAP2 mRNA 的表達(dá)情況（膽囊癌組織/癌旁膽囊組織,-ΔΔCt 值）表 1-1 膽囊癌組織、癌旁組織 cIAP2 mRNA 的表達(dá)情況分組 例數(shù) cIAP2 mRNA（2-△CT） 2-△△CTp膽囊癌組織 44 6.54±0.88 2.43 0.000旁膽囊組織 44 3.25±0.392、免疫組化檢測 cIAP2 蛋白在人的膽囊癌組織中的表達(dá)免疫組化檢測 cIAP2 蛋白在膽囊癌組織及相對應(yīng)的癌旁膽囊組織表達(dá)，結(jié)果顯示 cIAP2 蛋白在膽囊癌組織中表達(dá)高于正常膽囊組織（圖 1-2）。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示膽囊癌組織中 MOD=0.2854±0.0061，癌旁膽囊組織中 MOD=0.1722±0.0084，兩者差異有顯著性，P<0.05。

18圖 1-2 免疫組化檢測 cIAP2 蛋白在膽囊癌組織中的表達(dá)（A）膽囊癌組織；（B）正常膽囊組織cIAP2 mRNA 與膽囊癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系通過比較膽囊癌組織中 cIAP2 mRNA 表達(dá)情況與影響膽囊癌發(fā)生發(fā)展的幾要臨床病理因素（性別，年齡，腫瘤部位，腫瘤大小，病理類型，分化程

P2 與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系P2 mRNA 低表達(dá)的膽囊癌患者中位生存時間為 34 個月，cIAP2 膽囊癌患者中位生存時間為 18 個月，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)rank 值：4.508，P=0.03），見圖 1-3。2 年總體生存率，cIAP2的膽囊癌患者組明顯（16.7%）低于 cIAP2 低表達(dá)的膽囊癌患）。提示 cIAP2 mRNA 高表達(dá)的膽囊癌患者預(yù)后較差。21 7 14 13.227 23 6 1730 9 21 0.009 14 4 10
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本文編號：2840471