研究背景和目的:肺癌目前已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居首位的惡性腫瘤~([1]),主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer SCLC)及其他類型的肺癌,本課題主要針對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)功能展開(kāi)研究。隨著臨床技術(shù)的不斷發(fā)展放射治療成為NSCLC主要治療手段之一,雖然放射治療已經(jīng)取得一定臨床療效但并未明顯改善肺癌患者的預(yù)后。相關(guān)研究表明侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良的主要原因,同時(shí)放射性肺損傷(radiation-induced lung injury RILI)是肺癌放射治療過(guò)程中最主要?jiǎng)┝肯拗菩远拘砸蛩�。沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT6具有NAD+依賴性的蛋白去乙�；�、ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶等活性,是一種在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的調(diào)控蛋白~([2]),最新研究表明SIRT6在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面、炎癥反應(yīng)方面及放療抵抗方面具有重要作用,但SIRT6在肺癌中的機(jī)制研究依然有限。因此本課題初步探討了調(diào)控SIRT6表達(dá)對(duì)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)的影響及其可能的作用機(jī)制,同時(shí)檢測(cè)調(diào)控SIRT6后NSCLC細(xì)胞經(jīng)射線照射后的存活情況,明確SIRT6在NSCLC放射性肺損傷和放療抵抗中的作用,為肺癌的治療從基礎(chǔ)到臨床轉(zhuǎn)化提供了新的思路和理論依據(jù)。研究方法:1.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)SIRT6蛋白在肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá),構(gòu)建NSCLC細(xì)胞SIRT6過(guò)表達(dá)及敲除載體。包裝慢病毒感染A549、H1299細(xì)胞株,篩選出SIRT6過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除A549細(xì)胞中SIRT6,篩選出SIRT6敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。2.通過(guò)細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)探討調(diào)控SIRT6表達(dá)后對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在NSCLC細(xì)胞中調(diào)控SIRT6表達(dá)后EMT細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)篩選出SIRT6影響NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路。3.利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在NSCLC中調(diào)控SIRT6表達(dá)后相關(guān)炎癥因子表達(dá)的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)篩選出在順鉑刺激情況下影響炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路,初步探討SIRT6影響肺癌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。4.采用CCK-8法檢測(cè)在A549細(xì)胞中調(diào)控SIRT6表達(dá)后經(jīng)射線照射細(xì)胞生存曲線的變化,初步探討SIRT6對(duì)A549細(xì)胞射線照射后細(xì)胞存活率的影響,明確SIRT6在肺癌放療抵抗中的作用。研究結(jié)果:1.Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,SIRT6蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織;成功構(gòu)建NSCLC細(xì)胞SIRT6過(guò)表達(dá)、敲除細(xì)胞系,測(cè)序比對(duì)結(jié)果后顯示A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)SIRT6,A549細(xì)胞中成功敲除提前設(shè)計(jì)的SIRT6靶點(diǎn);Western blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中SIRT6蛋白表達(dá)明顯上調(diào),敲除成功細(xì)胞系中未見(jiàn)SIRT6蛋白表達(dá)。2.過(guò)表達(dá)SIRT6后A549細(xì)胞遷移未見(jiàn)明顯變化,而在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SIRT6后細(xì)胞遷移明顯受到抑制,A549細(xì)胞敲除SIRT6后形態(tài)明顯發(fā)生變化,由多角形或橢圓形細(xì)胞變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)成纖維樣細(xì)胞,是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithlial-mesenchymal transition簡(jiǎn)稱EMT)的主要特征,且細(xì)胞遷移明顯加快;侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SIRT6后A549細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少,敲除SIRT6呈相反結(jié)果。A549細(xì)胞敲除SIRT6后細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)量明顯下調(diào),細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、vimentin mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)。對(duì)于機(jī)制研究,通過(guò)Western blot技術(shù)篩選信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)加入ERK1/2信號(hào)通路激活劑EGF后SIRT6可抑制其磷酸化水平,而smad2/3等信號(hào)通路磷酸化水平未見(jiàn)明顯變化。以上結(jié)果提示我們SIRT6可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.在SIRT6過(guò)表達(dá)和敲除細(xì)胞系中分別加入順鉑誘導(dǎo)其炎癥反應(yīng)的發(fā)生,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)量情況,過(guò)表達(dá)SIRT6后A549細(xì)胞中IL-1A、IL-1B、IL-12mRNA表達(dá)量下調(diào),而敲除SIRT6后呈現(xiàn)相反的結(jié)果。過(guò)表達(dá)SIRT6后A549細(xì)胞中加入順鉑,30min后檢測(cè)p-NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)。據(jù)此我們推測(cè)在肺癌細(xì)胞中SIRT6可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)。4.對(duì)NSCLC細(xì)胞采用Simens ARTISTE直線加速器產(chǎn)生的6MV-X射線進(jìn)行體外細(xì)胞照射,源皮距SSD為100cm,射野10×10 cm,劑量率是600MU/min。按照0Gy、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy的射線劑量梯度進(jìn)行細(xì)胞照射,照射后48小時(shí)應(yīng)用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞存活情況,結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加過(guò)表達(dá)SIRT6后A549細(xì)胞存活率未見(jiàn)明顯變化,而敲除SIRT6后A549細(xì)胞存活率明顯增加。研究結(jié)論:SIRT6蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)低于癌旁組織;SIRT6可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路有效抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲遷移;SIRT6可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生;SIRT6可降低NSCLC細(xì)胞放療后細(xì)胞存活率,有助于解決肺癌放療抵抗問(wèn)題。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

（8）1×TBST：稱取 50ml1M Tris-HCl（PH8.0），45g NaCl，5ml Tween-2加水溶解后定容至 5L。2.實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)步驟首先收集臨床樣本，應(yīng)用 Western blot 技術(shù)檢測(cè) SIRT6 蛋白在 NSC癌中和癌旁組織中表達(dá)的差異，了解 SIRT6 在 NSCLC 組織中的表達(dá)情構(gòu)建 SIRT6 過(guò)表達(dá)、敲除質(zhì)粒，篩選出二者穩(wěn)定細(xì)胞株，通過(guò)基因測(cè)序術(shù)確定構(gòu)建質(zhì)粒的正確性；構(gòu)建成功的質(zhì)粒分別采用包裝慢病毒、瞬間染的方式，傳送到肺癌細(xì)胞中調(diào)控 SIRT6 表達(dá)。因成功構(gòu)建的質(zhì)粒具有呤霉素抗性（如圖 1-1），可通過(guò)加入嘌呤霉素篩選已轉(zhuǎn)染正確質(zhì)粒的細(xì)胞將篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞系利用 Western blot 技術(shù)檢測(cè) SIRT6 蛋白表達(dá)情況體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

SIRT6 對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)功能的影響及機(jī)制的初步探討 2015 級(jí)碩士學(xué)位畢業(yè)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 SIRT6 在肺癌中的表達(dá)情況：本部分通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)SIRT6蛋白在肺癌和癌旁組織中的達(dá)情況，共檢測(cè) 14 例癌及癌旁組織，其中腺癌和鱗癌各 7 對(duì)。結(jié)果顯不管是腺癌組織還是鱗癌組織，癌旁組織的 SIRT6 蛋白表達(dá)量明顯高于組織中（圖 1-2）。

圖 1-2 SIRT6 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)(T:腫瘤，N:癌旁)Figure 1-2 The expression of SIRT6 in NSCLC (T: Tumor, N: normal Tissue)細(xì)胞過(guò)表達(dá) SIRT6 基因的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 SIRT6 基因結(jié)果驗(yàn)證6 基因 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)大小帶，即為目的基因 SIRT6 條帶，如圖 1-2。
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本文編號(hào)：2840118