研究背景和目的:肺癌目前已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居首位的惡性腫瘤~([1]),主要分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer SCLC)及其他類型的肺癌,本課題主要針對NSCLC細胞生物學(xué)功能展開研究。隨著臨床技術(shù)的不斷發(fā)展放射治療成為NSCLC主要治療手段之一,雖然放射治療已經(jīng)取得一定臨床療效但并未明顯改善肺癌患者的預(yù)后。相關(guān)研究表明侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良的主要原因,同時放射性肺損傷(radiation-induced lung injury RILI)是肺癌放射治療過程中最主要劑量限制性毒性因素。沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT6具有NAD+依賴性的蛋白去乙�；�、ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶等活性,是一種在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)控蛋白~([2]),最新研究表明SIRT6在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面、炎癥反應(yīng)方面及放療抵抗方面具有重要作用,但SIRT6在肺癌中的機制研究依然有限。因此本課題初步探討了調(diào)控SIRT6表達對NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)的影響及其可能的作用機制,同時檢測調(diào)控SIRT6后NSCLC細胞經(jīng)射線照射后的存活情況,明確SIRT6在NSCLC放射性肺損傷和放療抵抗中的作用,為肺癌的治療從基礎(chǔ)到臨床轉(zhuǎn)化提供了新的思路和理論依據(jù)。研究方法:1.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測SIRT6蛋白在肺癌組織和正常肺組織中的表達,構(gòu)建NSCLC細胞SIRT6過表達及敲除載體。包裝慢病毒感染A549、H1299細胞株,篩選出SIRT6過表達的穩(wěn)定細胞系,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除A549細胞中SIRT6,篩選出SIRT6敲除的穩(wěn)定細胞系。2.通過細胞劃痕愈合試驗、transwell侵襲實驗探討調(diào)控SIRT6表達后對NSCLC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;利用實時定量RT-PCR檢測在NSCLC細胞中調(diào)控SIRT6表達后EMT細胞表面標志物表達的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)篩選出SIRT6影響NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的信號通路。3.利用實時定量RT-PCR檢測在NSCLC中調(diào)控SIRT6表達后相關(guān)炎癥因子表達的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)篩選出在順鉑刺激情況下影響炎癥反應(yīng)的信號通路,初步探討SIRT6影響肺癌細胞炎癥反應(yīng)的可能機制。4.采用CCK-8法檢測在A549細胞中調(diào)控SIRT6表達后經(jīng)射線照射細胞生存曲線的變化,初步探討SIRT6對A549細胞射線照射后細胞存活率的影響,明確SIRT6在肺癌放療抵抗中的作用。研究結(jié)果:1.Western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示,SIRT6蛋白在NSCLC癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織;成功構(gòu)建NSCLC細胞SIRT6過表達、敲除細胞系,測序比對結(jié)果后顯示A549細胞、H1299細胞成功過表達SIRT6,A549細胞中成功敲除提前設(shè)計的SIRT6靶點;Western blot技術(shù)檢測過表達細胞系中SIRT6蛋白表達明顯上調(diào),敲除成功細胞系中未見SIRT6蛋白表達。2.過表達SIRT6后A549細胞遷移未見明顯變化,而在H1299細胞中過表達SIRT6后細胞遷移明顯受到抑制,A549細胞敲除SIRT6后形態(tài)明顯發(fā)生變化,由多角形或橢圓形細胞變?yōu)榧氶L成纖維樣細胞,是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithlial-mesenchymal transition簡稱EMT)的主要特征,且細胞遷移明顯加快;侵襲實驗結(jié)果顯示過表達SIRT6后A549細胞侵襲數(shù)目明顯減少,敲除SIRT6呈相反結(jié)果。A549細胞敲除SIRT6后細胞上皮標志物E-cadherin mRNA表達量明顯下調(diào),細胞間質(zhì)標志物N-cadherin、vimentin mRNA表達量明顯上調(diào)。對于機制研究,通過Western blot技術(shù)篩選信號通路發(fā)現(xiàn)加入ERK1/2信號通路激活劑EGF后SIRT6可抑制其磷酸化水平,而smad2/3等信號通路磷酸化水平未見明顯變化。以上結(jié)果提示我們SIRT6可能通過ERK1/2信號通路抑制NSCLC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.在SIRT6過表達和敲除細胞系中分別加入順鉑誘導(dǎo)其炎癥反應(yīng)的發(fā)生,實時定量RT-PCR檢測相關(guān)炎癥因子mRNA表達量情況,過表達SIRT6后A549細胞中IL-1A、IL-1B、IL-12mRNA表達量下調(diào),而敲除SIRT6后呈現(xiàn)相反的結(jié)果。過表達SIRT6后A549細胞中加入順鉑,30min后檢測p-NF-κB蛋白表達下調(diào)。據(jù)此我們推測在肺癌細胞中SIRT6可能通過NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)。4.對NSCLC細胞采用Simens ARTISTE直線加速器產(chǎn)生的6MV-X射線進行體外細胞照射,源皮距SSD為100cm,射野10×10 cm,劑量率是600MU/min。按照0Gy、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy的射線劑量梯度進行細胞照射,照射后48小時應(yīng)用CCK-8試劑檢測細胞存活情況,結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加過表達SIRT6后A549細胞存活率未見明顯變化,而敲除SIRT6后A549細胞存活率明顯增加。研究結(jié)論:SIRT6蛋白在NSCLC組織中的表達低于癌旁組織;SIRT6可能通過ERK1/2信號通路有效抑制NSCLC細胞的侵襲遷移;SIRT6可能通過NF-κB信號通路抑制A549細胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生;SIRT6可降低NSCLC細胞放療后細胞存活率,有助于解決肺癌放療抵抗問題。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

（8）1×TBST：稱取 50ml1M Tris-HCl（PH8.0），45g NaCl，5ml Tween-2加水溶解后定容至 5L。2.實驗方法及實驗步驟首先收集臨床樣本，應(yīng)用 Western blot 技術(shù)檢測 SIRT6 蛋白在 NSC癌中和癌旁組織中表達的差異，了解 SIRT6 在 NSCLC 組織中的表達情構(gòu)建 SIRT6 過表達、敲除質(zhì)粒，篩選出二者穩(wěn)定細胞株，通過基因測序術(shù)確定構(gòu)建質(zhì)粒的正確性；構(gòu)建成功的質(zhì)粒分別采用包裝慢病毒、瞬間染的方式，傳送到肺癌細胞中調(diào)控 SIRT6 表達。因成功構(gòu)建的質(zhì)粒具有呤霉素抗性（如圖 1-1），可通過加入嘌呤霉素篩選已轉(zhuǎn)染正確質(zhì)粒的細胞將篩選出的穩(wěn)定細胞系利用 Western blot 技術(shù)檢測 SIRT6 蛋白表達情況體實驗步驟如下。

SIRT6 對非小細胞肺癌生物學(xué)功能的影響及機制的初步探討 2015 級碩士學(xué)位畢業(yè)3.實驗結(jié)果3.1 SIRT6 在肺癌中的表達情況：本部分通過Western blot技術(shù)檢測SIRT6蛋白在肺癌和癌旁組織中的達情況，共檢測 14 例癌及癌旁組織，其中腺癌和鱗癌各 7 對。結(jié)果顯不管是腺癌組織還是鱗癌組織，癌旁組織的 SIRT6 蛋白表達量明顯高于組織中（圖 1-2）。

圖 1-2 SIRT6 在非小細胞肺癌中的表達(T:腫瘤，N:癌旁)Figure 1-2 The expression of SIRT6 in NSCLC (T: Tumor, N: normal Tissue)細胞過表達 SIRT6 基因的穩(wěn)定細胞株篩選 SIRT6 基因結(jié)果驗證6 基因 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂凝膠電泳鑒定，可見大小帶，即為目的基因 SIRT6 條帶，如圖 1-2。
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本文編號：2840118