發(fā)布時(shí)間：2020-10-14 03:15

　　 癌癥是威脅人類健康的重大疾病之一。為了治愈癌癥,各國(guó)研究人員嘗試了多種抗腫瘤策略。近十年來(lái),隨著對(duì)人類免疫系統(tǒng)研究的逐步深入,免疫檢查點(diǎn)療法逐漸步入人們的視野。尤其是2014年后,隨著PD-1單抗的正式上市,利用免疫檢查點(diǎn)蛋白阻斷信號(hào)通路,并以此用來(lái)上調(diào)或者下調(diào)T細(xì)胞的活性。但隨著對(duì)PD-1單抗的耐藥性與自體免疫系統(tǒng)并發(fā)癥的產(chǎn)生,同為T細(xì)胞表面負(fù)調(diào)節(jié)分子的TIM-3逐漸被重視,越來(lái)越多的研究開(kāi)始重視TIM-3在各種疾病中的作用,并將其作為一種新的免疫檢查點(diǎn)分子。本文首先介紹了TIM-3分子的結(jié)構(gòu)特征、及其三個(gè)重要配體,其次描述了TIM-3與其配體間的相互作用,通過(guò)配體如Galectin-9等結(jié)合TIM-3導(dǎo)致Th1細(xì)胞的功能耗歇和最終凋亡,這種結(jié)合同時(shí)也調(diào)控Th1和Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌情況。因此構(gòu)建了可表達(dá)TIM-3序列的重組質(zhì)粒,其后,通過(guò)電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法用DNA直接免疫BALB/c小鼠,達(dá)到免疫周期后,取其脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,進(jìn)一步將TIM-3陽(yáng)性反應(yīng)的克隆號(hào)再進(jìn)行三次ELISA篩選,獲得多株分泌TIM-3單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆號(hào),最后將雜交瘤細(xì)胞注射到BALB/c小鼠腹腔中制備腹水并進(jìn)一步純化得到單抗。其次用Western blot、ELISA、EC_(50)、immunofluorescence、flow cytometry等方法鑒定抗體特異性識(shí)別與親和性的能力。并將純化后獲得的TIM-3單抗與PBMC、DC、DC-CIK、CD4~+T等T細(xì)胞共同孵育后,特異性地與T細(xì)胞表面的TIM-3分子結(jié)合,阻斷了TIM-3/Galectin-9通路,通過(guò)對(duì)其共培養(yǎng)后上清液中分泌的IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子含量的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TIM-3單抗與PBMC細(xì)胞混合孵育后,能夠有效殺傷U937、MDA-MB-231等腫瘤細(xì)胞系。最后在MDA-MB-231細(xì)胞系建模的雌性BALB/c裸鼠中,PD-1與TIM-3單抗聯(lián)用治療組相較于PD-1和TIM-3單抗組、Control組更能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況,提高荷瘤小鼠的生活質(zhì)量,并且延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。通過(guò)DNA免疫獲得的TIM-3單抗可以特異性的識(shí)別并與TIM-3分子結(jié)合,阻斷Galectin-9配體與TIM-3分子的通路,逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的耗竭現(xiàn)象,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖并激活其分泌細(xì)胞因子的能力。TIM-3單抗能有效封閉T細(xì)胞表面活化的TIM-3分子,在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中有效殺傷腫瘤細(xì)胞。掌握TIM-3受體分子與各類配體間信號(hào)通過(guò)介導(dǎo)關(guān)系后,將有利于TIM-3抗體的研發(fā)和功能檢測(cè),為未來(lái)利用TIM-3單抗有針對(duì)性地治療各種與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病,為腫瘤免疫治療開(kāi)辟一條新的途徑。
【學(xué)位單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

學(xué)碩士論文 免疫檢查點(diǎn) TIM-3 單抗的制備及其3 的分子結(jié)構(gòu)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域家族（T cell immunoglobulin aontaining molecules family，TIM），最初是由 Mcintire 等[4]在中發(fā)現(xiàn)的。其后，在人染色體 5q33.2 上也發(fā)現(xiàn)了 TIM 家族[5TIM-3 和 TIM-4 等多個(gè)受體分子。研究發(fā)現(xiàn)，只有在活化的達(dá) TIM-3 受體分子。其分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，基本由 22-124aa5-201aa 的黏蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和 224-301aa 的細(xì)胞質(zhì)尾部如下圖 1.1 所示：

路嚴(yán)重失調(diào)的情況下，將會(huì)引發(fā)各類自身系統(tǒng)性慢性疾病，對(duì)患者的生存質(zhì)量有較大的影響。在腫瘤免疫微環(huán)境中，HMGB1與腫瘤浸潤(rùn)的DC上的TIM-3相互作用，通過(guò)阻斷 Toll樣受體3（TLR3）、TLR7、TLR9及細(xì)胞質(zhì)中DNA和RNA相關(guān)的正常轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，減弱DNA預(yù)防治療及化療的效果。CEACAM1與TIM-3結(jié)合能抑制T細(xì)胞的作用并且是慢性病毒感染或者腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞功能耗竭的一種標(biāo)記[10]。大量的證據(jù)表明，TIM-3參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，并對(duì)疾病的免疫調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。1.3 TIM-3/Galectin-9 通路在腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制根據(jù)Ana C. Anderson[11]等的最新研究，闡述了TIM-3在腫瘤中的作用。如圖1.2所示：

浙江理工大學(xué)碩士論文 免疫檢查點(diǎn) TIM-3 單抗的制備及其功能測(cè)定（5）吸取400 μl 生理鹽水將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19]；2.4 結(jié)果與分析2.4.1 TIM-3 單抗在蛋白層面的特異性識(shí)別將 TIM-3 蛋白與 TIM-1、TIM-4 蛋白同時(shí)在 A、B 兩塊膠上上樣跑膠，在A 膠上所有上樣孔均孵育經(jīng) A 蛋白親和層析法獲得的 TIM-3 單抗，在 B 膠上 a孔孵育制備獲得的 TIM-3 單抗，b 孔、c 孔均孵育購(gòu)自 BD 公司的 TIM-1、TIM-4 單抗。Western blotting 結(jié)果顯示如下圖：
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2840096