肥胖是女性乳腺癌高危因素之一。研究報道肥胖相關基因—脂肪量和肥胖相關基因(Fat mass and obesity associated gene,FTO)的多個單核苷酸多態(tài)性位點與多種腫瘤的患病相關,包括乳腺癌。此外,最近的研究發(fā)現FTO是烷烴羥化酶(ALKB)(細菌DNA修復酶)蛋白家族成員之一,其主要的作用底物是6-甲基腺嘌呤(m~6A),是m~6A去甲基化修飾酶;而m~6A的甲基化修飾參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前,FTO在乳腺癌中的表達情況,尤其是不同乳腺癌分子亞型的表達情況,以及其去甲基化功能對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的影響目前尚不清楚。本論文旨在:(1)通過免疫組織化學方法檢測乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其配對的轉移灶中FTO蛋白表達,詳細收集臨床病理資料及隨訪數據,分析正常乳腺上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉移灶中FTO基因表達差異及其與各臨床參數、生存預后的關系;(2)建立野生型FTO與FTO R96Q錯義突變體過表達乳腺癌細胞株,及利用小干擾RNA干擾FTO的表達,分析FTO不同表達水平及去甲基功能變化后對乳腺癌細胞株RNA中m~6A水平變化,及乳腺癌細胞增殖、遷移、凋亡等生物行為的影響,并進一步檢測Vimentin、TGF-β1、C-myc等因子變化水平,初步探索其分子機制。第一部分乳腺癌組織中FTO蛋白表達水平與臨床病理特征、生存預后的關系目的:分析FTO蛋白在乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其相配對的轉移灶中的表達情況,探索乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉移灶中FTO蛋白表達差異與臨床病理特征、生存預后的關系。方法:1.研究收集2009年1月至2014年6月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院初診的乳腺癌病例108例,其中包括復發(fā)病例63例,隨訪3年無復發(fā)病例45例,同時收集乳腺正常上皮組織41例。所有乳腺癌患者均病理確診證實為浸潤性癌,其臨床和隨訪資料完整、原發(fā)癌灶及轉移癌灶組織蠟塊在我院病理科保存。2.用免疫組織化學方法檢測乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其相配對的轉移灶中FTO蛋白的表達情況,分析乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉移灶中FTO基因表達差異與臨床病理特征、分子分型及無復發(fā)生存之間的關系。結果1.FTO蛋白在乳腺正常上皮組織與乳腺癌組織中均有表達,FTO蛋白在乳腺癌原發(fā)灶中的表達水平要顯著高于乳腺正常上皮組織,差異具有統(tǒng)計學意義(高表達率:46.5%vs 29.3%,P=0.03)。利用BMI進行分層后,在BMI≥24的患者中,乳腺癌原發(fā)灶中FTO蛋白的表達水平要高于乳腺正常上皮組織(高表達率為:51.5%vs 25.0%),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.03);而在BMI﹤24的患者中,FTO蛋白在乳腺癌組織與乳腺正常上皮組織中表達無統(tǒng)計學差異;2.FTO蛋白在luminal型復發(fā)乳腺癌表達率為66.6%,顯著高于3年未復發(fā)的同型乳腺癌患者(高表達率:66.6%vs 33.3%,P=0.006);3.乳腺癌中FTO蛋白的表達水平與患者的年齡、BMI指數、G分級、T分期、N分期、臨床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表達均無明顯相關性(所有P﹥0.05)。4.分析復發(fā)患者,原發(fā)癌組織中FTO蛋白高表達患者的平均復發(fā)時間是1.9年,低FTO表達患者的平均復發(fā)時間是2.3年,兩組之間無顯著性差異;5.FTO蛋白在63例配對乳腺癌原發(fā)灶和轉移灶中高表達率分別為44.4%和49.2%,兩者之間的表達不存在顯著差異(P=0.590);但FTO在乳腺癌原發(fā)灶和轉移灶之間的總變化率為49.2%,分層分析:FTO在luminal B型、HER-2過表達型、base-like型乳腺癌原發(fā)灶和轉移灶中總變化率分別為:52.5%、50%、50%,不同分子分型中FTO蛋白在原發(fā)灶和轉移灶的表達未發(fā)現有明顯差異。結論1.FTO蛋白在乳腺癌組織中表達水平高于乳腺正常上皮組織;2.在Luminal型乳腺癌中,3年內復發(fā)患者的FTO蛋白表達水平顯著高于無復發(fā)患者,提示FTO可能是Luminal型乳腺癌早期復發(fā)的預測因子;3.FTO蛋白表達與乳腺癌患者的年齡、BMI指數、G分級、T分期、N分期、臨床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表達等臨床病理特征無明顯相關性;4.FTO蛋白乳腺癌原發(fā)病灶和對應的轉移灶中高表達率相似;但存在較高變化率。第二部分不同FTO表達狀況乳腺癌細胞株構建及鑒定目的:在人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231細胞中構建FTO不同表達水平及FTO R96Q錯義突變體細胞株,為探索FTO表達狀況對乳腺癌細胞生物行為的影響及分子機制奠定基礎。方法:構建表達不同FTO表達水平及FTO R96Q錯義突變體的慢病毒載體,測序等驗證其正確性;并感染人乳腺癌細胞系,用q RT-PCR和Western blot確定FTO在慢病毒載體轉染后感染效果。結果:1、構建FTO過表達及FTO R96Q錯義突變體質粒,并酶切及測序驗證正確;構建FTO sh RNA敲降質粒;2、MDA-MB-231細胞FTO mRNA的相對表達量在野生型FTO過表達質粒、FTO R96Q突變體過表達質粒組分別為7.66±0.398、3.50±0.431,均高于空載質粒組(1.64±0.036)(P均0.05);而si RNA2轉染后MDA-MB-231細胞FTO m RNA的相對表達量為:0.21±0.013,明顯低于空載質粒組(P0.05)。3、對不同質粒轉染后MDA-MB-231細胞FTO蛋白表達的變化同FTO m RNA變化是一致的,在野生型FTO過表達質粒組與FTO R96Q突變體過表達質粒組FTO表達量明顯升高;而在FTO si RNA干擾組FTO蛋白表達量顯著下降。4、MCF-7乳腺癌細胞中不同FTO慢病毒載體轉染后,FTO在m RNA及蛋白水平變化不顯著。結論:本實驗通過慢病毒載體轉染技術獲得了FTO基因不同表達狀況的MDA-MB-231細胞株。該細胞將用于后續(xù)研究FTO表達對細胞生物學行為能力的影響。第三部分:FTO基因表達水平及FTO-R96Q錯義突變體對乳腺癌細胞生物學行為影響的實驗研究目的:分析FTO不同表達水平及失去去甲基化功能對乳腺癌細胞RNA中m~6A含量、細胞增殖、遷移、凋亡等生物行為的影響,并進一步檢測Vimentin、TGF-β1等因子水平變化,初步探索其分子機制。方法:1.使用半定量試劑盒檢測不同FTO表達水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細胞RNA中m~6A含量。2.采用MTT法、Transwell小室法檢測不同FTO表達水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細胞株增殖、遷移能力變化;3.采用流式細胞技術分析不同FTO表達水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細胞株細胞周期、細胞凋亡的改變;4.采用實時熒光定量PCR技術分析Vimentin、TGF-β1、Cycln D1、C-myc等腫瘤遷移、增殖相關分子m RNA水平的變化情況;結果:1.FTO過表達后MDA-MB-231細胞RNA中m~6A的含量下降了15%;干擾FTO表達后MDA-MB-231細胞RNA中m~6A的含量增加了79%;轉染FTO R96Q突變質粒后,MDA-MB-231細胞RNA中m~6A含量增加了30%;2.MTT結果表明,野生型FTO過表達細胞株在24、48、72、96小時的吸光度分別為:0.335±0.01、0.60±0.07、0.867±0.147、1.216±0.006與空載質粒組對應時間的吸光度值0.305±0.004、0.452±0.182、0.615±0.015、0.882±0.012相似,FTO si RNA質粒不同時間的吸光度同空載質粒也無明顯差別;而FTO R96Q突變體過表達質粒細胞株24、48、72、96小時的吸光度分別為0.542±0.009、0.860±0.01、1.13±0.048、1.238±0.010高于空載質粒組。3.Transwell結果顯示:野生型FTO過表達組MDA-MB-231細胞穿膜細胞數為167.4±10.2,明顯多于空載質粒組(41.6±6.3)(P0.01);si RNA干擾組中穿過膜的細胞數為32.5±4.8,略少于空載質粒組的穿膜細胞數,差異無統(tǒng)計學意義;FTO R96Q突變體過表達質粒組的穿板數目為78±7,較空載質粒組增多,卻顯著少于野生型FTO過表達組。4.細胞周期結果顯示:野生型FTO過表達組、FTO R96Q突變體過表達質粒組及si RNA干擾組三組間的MDA-MB-231細胞周期構成無明顯差異(P值﹥0.05)。5.細胞凋亡的研究顯示:干擾FTO表達后,MDA-MB-231細胞總凋亡率為18.12%,明顯高于空載質粒組(7.01%);野生型FTO過表達組細胞凋亡率為3.16%,明顯低于空載質粒組;FTO R96Q突變體過表達質粒組細胞凋亡率為12.31%,顯著高于空載質粒組,差異有統(tǒng)計學意義。6.腫瘤遷移、增殖相關因子RT-PCR顯示,野生型FTO過表達組中Vimentin、TGF-β1 m RNA水平有不同程度的上調,而在轉染FTO R96Q錯義突變質粒的MDA-MB-231細胞中Vimentin顯著下調、TGF-β1 m RNA水平變化不明顯。而干擾FTO表達后MDA-MB-231細胞的Vimentin m RNA水平表達下調、TGF-β1 m RNA表達明顯上調;對于腫瘤增殖相關因子,野生型FTO過表達組MDA-MB-231細胞Cyclin D1 m RNA水平無明顯變化,C-myc有輕度上調,FTO R96Q突變體過表達質粒組中細胞Cyciln D1以及C-myc m RNA水平明顯下調,而干擾FTO表達后MDA-MB-231細胞的Cyclin D1 m RNA下調,c-myc m RNA上調。結論:1.在MDA-MB-231細胞中FTO過表達降低了m~6A水平,FTO去甲基化功能喪失后明顯增加了m~6A水平;干擾FTO表達后m~6A表達水平也明顯升高;2.轉染FTO R96Q錯義突變質粒后MDA-MB-231細胞增殖能力增強,MDA-MB-231細胞中過表達、干擾FTO表達后細胞增殖能力變化不顯著;3.野生型FTO過表達的MDA-MB-231細胞株遷移能力明顯增強,FTO R96Q錯義突變過表達后的MDA-MB-231細胞高遷移能力明顯下降;干擾FTO表達后MDA-MB-231細胞遷移能力明顯減弱。4.FTO表達對MDA-MB-231細胞周期無影響;5.干擾FTO表達后MDA-MB-231細胞的凋亡率明顯增加,過表達后MDA-MB-231細胞的凋亡率明顯降低,轉染FTO R96Q錯義突變質粒細胞凋亡明顯增加;6.FTO基因過表達組MDA-MB-231細胞TGF-β1、Vimentin mRNA表達上調;干擾FTO表達或FTO喪失去甲基化活性Vimentin m RNA下調,提示FTO基因可能通過TGF-β1通路影響細胞的遷移能力,這種作用可能與其去甲基化作用有關。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

圖 1-1 FTO 在乳腺癌組織中表達強度的分級A-(-), B-(+), C-(++),D-(+++)Figure 1-1 FTO intensify staining in brest cancer tissues and normal breast tissue：(A)no staining；(B)weak intensity(1+)，(c)moderate intensity(2+)，(D)strong intensity(3+). See text for details of stainintensity scoring.

發(fā)與未復發(fā)乳腺癌 FTO 表達差異-M 生存曲線顯示，3 年左右兩條曲線明顯分離了乳腺癌患者早期復發(fā)；我們將 3 年內復發(fā)患圖 1-2 乳腺癌組織中 FTO 蛋白表達對無復發(fā)生存(RFS)的影Fig.1-2 The correlation between the expression level of FTO proteiprimary cancer tissues and the recurrence time

67圖 2-2 FTO 基因過表達/FTOR96Q 錯義突變體質粒合成后酶切及測序驗 AFTO 過表達慢病毒質粒，KpnI、NotI 酶切鑒定；B FTO R96Q 錯義突變質粒，切鑒定TO 過表達慢病毒質粒測序結果（紅線標注處：CGC）；D：FTO R96Q 錯義突變質果（紅線標注處：CAG）
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張潔蕾;鄭麗麗;;FTO基因表達水平與乳腺癌的相關性研究[J];中國實用醫(yī)刊;2014年09期

2 李泓瀾;高玉堂;李琦;劉大可;;身體測量指標與女性乳腺癌關系的前瞻性隊列研究[J];中華流行病學雜志;2006年06期

本文編號：2839774