肥胖是女性乳腺癌高危因素之一。研究報(bào)道肥胖相關(guān)基因—脂肪量和肥胖相關(guān)基因(Fat mass and obesity associated gene,FTO)的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與多種腫瘤的患病相關(guān),包括乳腺癌。此外,最近的研究發(fā)現(xiàn)FTO是烷烴羥化酶(ALKB)(細(xì)菌DNA修復(fù)酶)蛋白家族成員之一,其主要的作用底物是6-甲基腺嘌呤(m~6A),是m~6A去甲基化修飾酶;而m~6A的甲基化修飾參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前,FTO在乳腺癌中的表達(dá)情況,尤其是不同乳腺癌分子亞型的表達(dá)情況,以及其去甲基化功能對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的影響目前尚不清楚。本論文旨在:(1)通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其配對(duì)的轉(zhuǎn)移灶中FTO蛋白表達(dá),詳細(xì)收集臨床病理資料及隨訪數(shù)據(jù),分析正常乳腺上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中FTO基因表達(dá)差異及其與各臨床參數(shù)、生存預(yù)后的關(guān)系;(2)建立野生型FTO與FTO R96Q錯(cuò)義突變體過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株,及利用小干擾RNA干擾FTO的表達(dá),分析FTO不同表達(dá)水平及去甲基功能變化后對(duì)乳腺癌細(xì)胞株RNA中m~6A水平變化,及乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物行為的影響,并進(jìn)一步檢測(cè)Vimentin、TGF-β1、C-myc等因子變化水平,初步探索其分子機(jī)制。第一部分乳腺癌組織中FTO蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征、生存預(yù)后的關(guān)系目的:分析FTO蛋白在乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其相配對(duì)的轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況,探索乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中FTO蛋白表達(dá)差異與臨床病理特征、生存預(yù)后的關(guān)系。方法:1.研究收集2009年1月至2014年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院初診的乳腺癌病例108例,其中包括復(fù)發(fā)病例63例,隨訪3年無復(fù)發(fā)病例45例,同時(shí)收集乳腺正常上皮組織41例。所有乳腺癌患者均病理確診證實(shí)為浸潤性癌,其臨床和隨訪資料完整、原發(fā)癌灶及轉(zhuǎn)移癌灶組織蠟塊在我院病理科保存。2.用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)癌灶及其相配對(duì)的轉(zhuǎn)移灶中FTO蛋白的表達(dá)情況,分析乳腺正常上皮組織、乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中FTO基因表達(dá)差異與臨床病理特征、分子分型及無復(fù)發(fā)生存之間的關(guān)系。結(jié)果1.FTO蛋白在乳腺正常上皮組織與乳腺癌組織中均有表達(dá),FTO蛋白在乳腺癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平要顯著高于乳腺正常上皮組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(高表達(dá)率:46.5%vs 29.3%,P=0.03)。利用BMI進(jìn)行分層后,在BMI≥24的患者中,乳腺癌原發(fā)灶中FTO蛋白的表達(dá)水平要高于乳腺正常上皮組織(高表達(dá)率為:51.5%vs 25.0%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03);而在BMI﹤24的患者中,FTO蛋白在乳腺癌組織與乳腺正常上皮組織中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2.FTO蛋白在luminal型復(fù)發(fā)乳腺癌表達(dá)率為66.6%,顯著高于3年未復(fù)發(fā)的同型乳腺癌患者(高表達(dá)率:66.6%vs 33.3%,P=0.006);3.乳腺癌中FTO蛋白的表達(dá)水平與患者的年齡、BMI指數(shù)、G分級(jí)、T分期、N分期、臨床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表達(dá)均無明顯相關(guān)性(所有P﹥0.05)。4.分析復(fù)發(fā)患者,原發(fā)癌組織中FTO蛋白高表達(dá)患者的平均復(fù)發(fā)時(shí)間是1.9年,低FTO表達(dá)患者的平均復(fù)發(fā)時(shí)間是2.3年,兩組之間無顯著性差異;5.FTO蛋白在63例配對(duì)乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)率分別為44.4%和49.2%,兩者之間的表達(dá)不存在顯著差異(P=0.590);但FTO在乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的總變化率為49.2%,分層分析:FTO在luminal B型、HER-2過表達(dá)型、base-like型乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中總變化率分別為:52.5%、50%、50%,不同分子分型中FTO蛋白在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有明顯差異。結(jié)論1.FTO蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)水平高于乳腺正常上皮組織;2.在Luminal型乳腺癌中,3年內(nèi)復(fù)發(fā)患者的FTO蛋白表達(dá)水平顯著高于無復(fù)發(fā)患者,提示FTO可能是Luminal型乳腺癌早期復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子;3.FTO蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、BMI指數(shù)、G分級(jí)、T分期、N分期、臨床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表達(dá)等臨床病理特征無明顯相關(guān)性;4.FTO蛋白乳腺癌原發(fā)病灶和對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)率相似;但存在較高變化率。第二部分不同F(xiàn)TO表達(dá)狀況乳腺癌細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定目的:在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中構(gòu)建FTO不同表達(dá)水平及FTO R96Q錯(cuò)義突變體細(xì)胞株,為探索FTO表達(dá)狀況對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物行為的影響及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:構(gòu)建表達(dá)不同F(xiàn)TO表達(dá)水平及FTO R96Q錯(cuò)義突變體的慢病毒載體,測(cè)序等驗(yàn)證其正確性;并感染人乳腺癌細(xì)胞系,用q RT-PCR和Western blot確定FTO在慢病毒載體轉(zhuǎn)染后感染效果。結(jié)果:1、構(gòu)建FTO過表達(dá)及FTO R96Q錯(cuò)義突變體質(zhì)粒,并酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確;構(gòu)建FTO sh RNA敲降質(zhì)粒;2、MDA-MB-231細(xì)胞FTO mRNA的相對(duì)表達(dá)量在野生型FTO過表達(dá)質(zhì)粒、FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組分別為7.66±0.398、3.50±0.431,均高于空載質(zhì)粒組(1.64±0.036)(P均0.05);而si RNA2轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞FTO m RNA的相對(duì)表達(dá)量為:0.21±0.013,明顯低于空載質(zhì)粒組(P0.05)。3、對(duì)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞FTO蛋白表達(dá)的變化同F(xiàn)TO m RNA變化是一致的,在野生型FTO過表達(dá)質(zhì)粒組與FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組FTO表達(dá)量明顯升高;而在FTO si RNA干擾組FTO蛋白表達(dá)量顯著下降。4、MCF-7乳腺癌細(xì)胞中不同F(xiàn)TO慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,FTO在m RNA及蛋白水平變化不顯著。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得了FTO基因不同表達(dá)狀況的MDA-MB-231細(xì)胞株。該細(xì)胞將用于后續(xù)研究FTO表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為能力的影響。第三部分:FTO基因表達(dá)水平及FTO-R96Q錯(cuò)義突變體對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:分析FTO不同表達(dá)水平及失去去甲基化功能對(duì)乳腺癌細(xì)胞RNA中m~6A含量、細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物行為的影響,并進(jìn)一步檢測(cè)Vimentin、TGF-β1等因子水平變化,初步探索其分子機(jī)制。方法:1.使用半定量試劑盒檢測(cè)不同F(xiàn)TO表達(dá)水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細(xì)胞RNA中m~6A含量。2.采用MTT法、Transwell小室法檢測(cè)不同F(xiàn)TO表達(dá)水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細(xì)胞株增殖、遷移能力變化;3.采用流式細(xì)胞技術(shù)分析不同F(xiàn)TO表達(dá)水平及去甲基化功能變化后MDA-MB-231細(xì)胞株細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的改變;4.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析Vimentin、TGF-β1、Cycln D1、C-myc等腫瘤遷移、增殖相關(guān)分子m RNA水平的變化情況;結(jié)果:1.FTO過表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞RNA中m~6A的含量下降了15%;干擾FTO表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞RNA中m~6A的含量增加了79%;轉(zhuǎn)染FTO R96Q突變質(zhì)粒后,MDA-MB-231細(xì)胞RNA中m~6A含量增加了30%;2.MTT結(jié)果表明,野生型FTO過表達(dá)細(xì)胞株在24、48、72、96小時(shí)的吸光度分別為:0.335±0.01、0.60±0.07、0.867±0.147、1.216±0.006與空載質(zhì)粒組對(duì)應(yīng)時(shí)間的吸光度值0.305±0.004、0.452±0.182、0.615±0.015、0.882±0.012相似,FTO si RNA質(zhì)粒不同時(shí)間的吸光度同空載質(zhì)粒也無明顯差別;而FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞株24、48、72、96小時(shí)的吸光度分別為0.542±0.009、0.860±0.01、1.13±0.048、1.238±0.010高于空載質(zhì)粒組。3.Transwell結(jié)果顯示:野生型FTO過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為167.4±10.2,明顯多于空載質(zhì)粒組(41.6±6.3)(P0.01);si RNA干擾組中穿過膜的細(xì)胞數(shù)為32.5±4.8,略少于空載質(zhì)粒組的穿膜細(xì)胞數(shù),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組的穿板數(shù)目為78±7,較空載質(zhì)粒組增多,卻顯著少于野生型FTO過表達(dá)組。4.細(xì)胞周期結(jié)果顯示:野生型FTO過表達(dá)組、FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組及si RNA干擾組三組間的MDA-MB-231細(xì)胞周期構(gòu)成無明顯差異(P值﹥0.05)。5.細(xì)胞凋亡的研究顯示:干擾FTO表達(dá)后,MDA-MB-231細(xì)胞總凋亡率為18.12%,明顯高于空載質(zhì)粒組(7.01%);野生型FTO過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率為3.16%,明顯低于空載質(zhì)粒組;FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率為12.31%,顯著高于空載質(zhì)粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.腫瘤遷移、增殖相關(guān)因子RT-PCR顯示,野生型FTO過表達(dá)組中Vimentin、TGF-β1 m RNA水平有不同程度的上調(diào),而在轉(zhuǎn)染FTO R96Q錯(cuò)義突變質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞中Vimentin顯著下調(diào)、TGF-β1 m RNA水平變化不明顯。而干擾FTO表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞的Vimentin m RNA水平表達(dá)下調(diào)、TGF-β1 m RNA表達(dá)明顯上調(diào);對(duì)于腫瘤增殖相關(guān)因子,野生型FTO過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞Cyclin D1 m RNA水平無明顯變化,C-myc有輕度上調(diào),FTO R96Q突變體過表達(dá)質(zhì)粒組中細(xì)胞Cyciln D1以及C-myc m RNA水平明顯下調(diào),而干擾FTO表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞的Cyclin D1 m RNA下調(diào),c-myc m RNA上調(diào)。結(jié)論:1.在MDA-MB-231細(xì)胞中FTO過表達(dá)降低了m~6A水平,FTO去甲基化功能喪失后明顯增加了m~6A水平;干擾FTO表達(dá)后m~6A表達(dá)水平也明顯升高;2.轉(zhuǎn)染FTO R96Q錯(cuò)義突變質(zhì)粒后MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)、干擾FTO表達(dá)后細(xì)胞增殖能力變化不顯著;3.野生型FTO過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞株遷移能力明顯增強(qiáng),FTO R96Q錯(cuò)義突變過表達(dá)后的MDA-MB-231細(xì)胞高遷移能力明顯下降;干擾FTO表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力明顯減弱。4.FTO表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期無影響;5.干擾FTO表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率明顯增加,過表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率明顯降低,轉(zhuǎn)染FTO R96Q錯(cuò)義突變質(zhì)粒細(xì)胞凋亡明顯增加;6.FTO基因過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞TGF-β1、Vimentin mRNA表達(dá)上調(diào);干擾FTO表達(dá)或FTO喪失去甲基化活性Vimentin m RNA下調(diào),提示FTO基因可能通過TGF-β1通路影響細(xì)胞的遷移能力,這種作用可能與其去甲基化作用有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

圖 1-1 FTO 在乳腺癌組織中表達(dá)強(qiáng)度的分級(jí)A-(-), B-(+), C-(++),D-(+++)Figure 1-1 FTO intensify staining in brest cancer tissues and normal breast tissue：(A)no staining；(B)weak intensity(1+)，(c)moderate intensity(2+)，(D)strong intensity(3+). See text for details of stainintensity scoring.

發(fā)與未復(fù)發(fā)乳腺癌 FTO 表達(dá)差異-M 生存曲線顯示，3 年左右兩條曲線明顯分離了乳腺癌患者早期復(fù)發(fā)；我們將 3 年內(nèi)復(fù)發(fā)患圖 1-2 乳腺癌組織中 FTO 蛋白表達(dá)對(duì)無復(fù)發(fā)生存(RFS)的影Fig.1-2 The correlation between the expression level of FTO proteiprimary cancer tissues and the recurrence time

67圖 2-2 FTO 基因過表達(dá)/FTOR96Q 錯(cuò)義突變體質(zhì)粒合成后酶切及測(cè)序驗(yàn) AFTO 過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，KpnI、NotI 酶切鑒定；B FTO R96Q 錯(cuò)義突變質(zhì)粒，切鑒定TO 過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果（紅線標(biāo)注處：CGC）；D：FTO R96Q 錯(cuò)義突變質(zhì)果（紅線標(biāo)注處：CAG）
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張潔蕾;鄭麗麗;;FTO基因表達(dá)水平與乳腺癌的相關(guān)性研究[J];中國實(shí)用醫(yī)刊;2014年09期

2 李泓瀾;高玉堂;李琦;劉大可;;身體測(cè)量指標(biāo)與女性乳腺癌關(guān)系的前瞻性隊(duì)列研究[J];中華流行病學(xué)雜志;2006年06期

本文編號(hào)：2839774