研究背景:急性T淋巴細胞白血病(Acute T cell leukemia,T-ALL)是一組起源于T系淋巴祖細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,多見于兒童及40歲以上成人。T-ALL患者通常白細胞高,易浸潤神經(jīng)系統(tǒng),并伴有縱隔腫塊。據(jù)統(tǒng)計約70%病人伴有Notch1基因的突變,突變Notch1基因參與T-ALL腫瘤細胞增殖、分化、代謝等多種細胞活動。在我們的前期研究中,成功建立了Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚,并且通過轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出差異表達基因,發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK6等基因高表達。因此本文旨在研究CDK4/6是否在Notch1高表達的T-ALL發(fā)病中起到一定作用?CDK4/6選擇性抑制劑Palbociclib,能否逆轉(zhuǎn)部分白血病細胞增殖。研究目的:應(yīng)用Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚與T-ALL細胞株,探討Notch1高表達T-ALL發(fā)病中細胞增殖相關(guān)的體內(nèi)、外機制研究,并應(yīng)用細胞周期抑制劑進行靶向藥物干預(yù)效價探索。研究方法:體內(nèi)實驗,分別選用Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚系以及野生斑馬魚系作為實驗組和對照組,對兩組進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,遴選Notch1可能的靶基因;選用差異基因的抑制劑進行活體干預(yù),RT-qPCR方法定量檢測基因表達。體外實驗,分別選取高表達Notch1的T-ALL細胞株(A3、MOLT-4)與正常人外周血單個核細胞為實驗組和對照組,PCR方法用于檢測兩組細胞中Notch1信號相關(guān)基因的表達;CCK8法檢測Palbociclib對上述細胞的增殖抑制率;細胞涂片觀察細胞的增殖及形態(tài);并利用流式細胞術(shù)分析兩組細胞在Palbociclib不同濃度時的細胞周期;及RT-qPCR檢測相關(guān)基因表達。研究結(jié)果:在Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚中轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果提示CDK4/6高表達,RT-qPCR檢測不同濃度Palbociclib(0、50、100nM)處理后的斑馬魚標本,上述基因表達被抑制。常規(guī)PCR檢測在T-ALL細胞株同樣高表達CDK4/6、Myc、Notch1等基因。細胞周期分析,Palbociclib處理前,A3、MLOT-4的(S+G2)期分別為(55.93±1.18)%及(58.17±2.40)%,高于對照組(48.93±1.85)%);藥物處理后,兩組細胞均呈濃度依賴的(S+G2)期下降(P0.05);細胞血檢查發(fā)現(xiàn),100nM濃度時,T-ALL細胞株的(S+G2)期細胞接近對照組(P0.05)。RT-qPCR結(jié)果提示,相比0nM濃度,CDK4/6在50、100nM濃度時表達下降,并與濃度呈正相關(guān),而Myc、Notch1基因在50nM時無差異,Myc基因在100nM時表達下調(diào),而Notch1基因在100nM時表達上調(diào)(P0.05)。研究結(jié)論:在Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚和Notch1高表達的T-ALL細胞株高表達CDK4/6、Myc等基因,Palbociclib不僅可以通過抑制CDK4/6使腫瘤細胞阻滯在G1期,使增殖受抑,并且可以抑制T-ALL下游基因Myc的表達而抑制腫瘤細胞增殖,可以對抗部分Notch1對腫瘤細胞的促進增殖作用。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R733.71
【部分圖文】：

圖 2-1. 陰性對照斑與 Notch1馬魚；Figure2-1. Heatmap of theNotch12.5.2 RT-qPCR 定量檢測 Notch1為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖 2-2Notch1、Myc 等 Notch1 信號通路相關(guān)基因CDK6 等基因（P < 0.05）。轉(zhuǎn)基因斑馬魚差異基因群聚類圖。F: fli1 對照組斑N: Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚。difference genes between negative control grouptransgenic zebrafish.轉(zhuǎn)基因斑馬魚相關(guān)基因表達Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚與 Tg 斑馬魚存在的差異基因，2），相比對照組斑馬魚系，Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚信號通路相關(guān)基因（P < 0.05），以及細胞周期相關(guān)基因and轉(zhuǎn)基因斑馬魚高表達細胞周期相關(guān)基因 CDK

2-2. Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平照組，NOTCH1: Notch1，Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚基因igure2-2．Transcri周期選擇性抑制劑otch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎經(jīng)不同濃度（iclib 處理 72h 后，應(yīng)用表明，Palbociclib 將 80μM (1/2 LC50)A。Tg: (fli1:EGFP)斑馬魚轉(zhuǎn)基因斑馬魚；RT-qPCR 結(jié)果提示，相比對轉(zhuǎn)基因斑馬魚高表達 Notch1、Myc、CDK4、CDK6。（兩組組間比較采用配對 t 檢驗，* P<0.0；**P < 0.01）Transcriptional levels of the genes in Notch1 transgeneic fPalbociclib 藥物作用斑馬魚胚胎經(jīng)不同濃度（50、100、 200、 400后，應(yīng)用顯微鏡觀測并記錄其生存狀況，斑馬魚的半數(shù)致死濃度 LC50 是 162.8 ±8.16μM（見Palbociclib 作為后續(xù)實驗的最大濃度。、斑馬魚實驗的最大濃度。

Palbociclib 在斑馬魚的半數(shù)致死量 LC50 A. Palbociclib 處理 72h 時的生存狀況，并記錄得出的統(tǒng)計數(shù)字。（藍色代表生存死）。B.利用 graphad 將 A 的數(shù)據(jù)處理后計算得到 LC50 的圖示，Notch1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚的 LC50=（162.8±8.16）μM。-3. Maximum non-lethal concentration and LC50 determinatPalbociclib.lib 處理后的基因表達水平改變結(jié)果顯示（圖 2-4）， Palbociclib 應(yīng)用可以顯著下調(diào) 的關(guān)鍵基因（CDK4、CDK6）,并隨 Palbociclib 濃度 2-4A）。而對于 Notch1 信號通路的基因，相比 0μM,其otch1、Myc 的轉(zhuǎn)錄水平均沒有明顯改變（P > 0.05）；8下降（P < 0.05），然而 Notch1 相比對照濃度反而輕微上
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本文編號：2836497