隨著手術(shù)和化療的發(fā)展,結(jié)直腸癌(CRC)的治療策略不斷進(jìn)步,但在療效和不良副反應(yīng)方面仍面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。最近免疫治療得到大家的廣泛認(rèn)可,對某些類型的癌癥也包括結(jié)直腸癌的治療取得了突破性的進(jìn)展。同時,優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的新型疫苗正在研發(fā)。以重組抗原或多肽為基礎(chǔ)設(shè)計的多肽疫苗由于具有良好的特異性和安全性,有望成為傳統(tǒng)疫苗的替代品。從另一方面來說,聚合物納米顆粒具有強(qiáng)大的負(fù)載抗原能力,較好的生物相容性,靈活的可修飾性等特點(diǎn)使其作為抗原載體在腫瘤免疫治療中具有突出的優(yōu)勢。因此作為新型疫苗的納米顆粒疫苗正在受到越來越多的關(guān)注。然而,有效地激活體內(nèi)抗腫瘤免疫以達(dá)到治療腫瘤的目的仍然是開發(fā)疫苗的一個重大的挑戰(zhàn)。本文采用生物相容性良好、負(fù)載量高的聚多巴胺納米顆粒(PDANPs)負(fù)載腫瘤模式抗原OVA或腫瘤細(xì)胞裂解物,并對其進(jìn)行了體內(nèi)外免疫學(xué)評估及抗腫瘤效果測試,評價PDANPs負(fù)載單一抗原及復(fù)合抗原后對結(jié)腸癌荷瘤鼠抗腫瘤免疫效果,為PDANPs應(yīng)用到腫瘤免疫領(lǐng)域提供基礎(chǔ)實(shí)驗數(shù)據(jù)和參考。論文主要分為以下三個部分:第一部分描述了攜帶腫瘤模式抗原OVA和綠色熒光蛋白(GFP)的OVA-GMC38結(jié)腸癌細(xì)胞系的構(gòu)建。首先設(shè)計并構(gòu)建了攜帶腫瘤模式抗原OVA和GFP報告基因的雙基因慢病毒載體。采用嘌呤霉素在該慢病毒感染的MC38細(xì)胞中篩選陽性O(shè)VA-GMC38細(xì)胞。通過激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測出GFP和OVA基因在MC38細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。在C57BL/6小鼠皮下種植OVA-GMC38,考察其對荷瘤小鼠動物模型建立的影響,實(shí)驗結(jié)果表明與MC38相比,基因轉(zhuǎn)染對OVA-GMC38結(jié)腸癌細(xì)胞系致瘤能力沒有影響。利用OVA免疫荷瘤小鼠,初步結(jié)果顯示OVA-GMC38可用于評價結(jié)腸癌中針對OVA抗原的免疫治療效果。第二部分研究了負(fù)載模式抗原OVA的聚多巴胺納米顆粒(OVA@PDANPs)的表征和治療功效。制備OVA@PDANPs作為腫瘤疫苗,通過粒徑分析儀及掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒成均勻的、單分散的球形,細(xì)胞毒性實(shí)驗表明納米顆粒具有良好的生物相容性。共聚焦顯微鏡觀察納米顆粒吞噬發(fā)現(xiàn)納米顆粒能夠增加細(xì)胞對抗原的吞噬,并且被細(xì)胞內(nèi)化的納米顆粒可實(shí)現(xiàn)部分溶酶體逃逸。活體成像研究結(jié)果說明OVA@PDANPs能夠促進(jìn)抗原在淋巴結(jié)處的聚集,并延長抗原滯留時間。而后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果說明OVA@PDANPs能夠促進(jìn)淋巴結(jié)內(nèi)DCs表面成熟標(biāo)志物的表達(dá)。建立OVA-GMC38結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型,對荷瘤小鼠的免疫實(shí)驗表明OVA@PDANPs能夠明顯抑制腫瘤的生長,提高脾臟、淋巴結(jié)、腫瘤組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例,促進(jìn)了 T細(xì)胞反應(yīng)和T細(xì)胞增殖,改善腫瘤中免疫抑制的微環(huán)境。研究結(jié)果表明OVA@PDANPs具有良好的免疫刺激作用,具有應(yīng)用為腫瘤疫苗的潛力。第三部分聚焦于負(fù)載腫瘤裂解物的聚多巴胺納米顆粒(TCL@PDANPs)的研究。通過多巴胺自聚合制備PDANPs,再通過Michael加成和Schiff堿反應(yīng)將腫瘤裂解物(TCL)共價連接到PDANPs的表面上。TCL@PDANPs的平均尺寸為241.9nm,多分散指數(shù)為0.200,具有良好的儲存穩(wěn)定性,對APC具有低的細(xì)胞毒性。此外,TCL@PDA NPs促進(jìn)抗原攝取和DC成熟,導(dǎo)致DC細(xì)胞表面與抗原提呈相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌增強(qiáng)。用TCL@PDANPs免疫荷瘤小鼠后,腫瘤進(jìn)展顯著延遲,細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞亞群顯著增加,從而提供長期的抗腫瘤保護(hù)。此外,腫瘤內(nèi)顯著增多的CTL和明顯銳減的M1型TAM以及骨髓來源的免疫抑制細(xì)胞提示TCL@PDA NPs具有突出的抗腫瘤能力。總體而言,由于抗原加載方法簡單、制備快速、有效的激活免疫和突出的抗腫瘤能力,作為抗原遞送載體,PDANPs是極具潛力的候選者。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34;R318.08
【部分圖文】：

為了驗證ＯＶＡ基因表達(dá)情況，提�。希郑粒牵停茫常讣�(xì)胞總ＲＮＡ和膜蛋白，分??別通過ｑＲＴ－ＰＣＲ和ＷＢ從ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)水平檢測ＯＶＡ基因的表達(dá)。０ＶＡ－ＧＭＣ３８??細(xì)胞中ＯＶＡ表達(dá)水平高于未感染的ＭＣ３８細(xì)胞約６９倍（圖２．４）。ＷＢ方法檢測結(jié)??果顯示（圖２．５），作為陽性對照的Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細(xì)胞有明顯的ＯＶＡ表達(dá)（以膜蛋白??內(nèi)參Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度比值為０．７１），ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞中也有ＯＶＡ??表達(dá)（以膜蛋白內(nèi)參Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度比值為１．１１），而ＭＣ３８和空??病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（ＫＢ－ＭＣ３８）中無ＯＶＡ表達(dá)。上述實(shí)驗結(jié)果提示經(jīng)過篩選，獲得??了?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞的穩(wěn)定株。??１００－１???Ｉ?氺氺氺?Ｉ??屮?８０＿?１?＇??＾６０－?＿??？?４０－??Ｂ??２０－??０－＊?１?＊???ＭＣ３８?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??圖２．４?ＭＣ３８細(xì)胞、ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞ＯＶＡｍＲＮＡ表達(dá)水平??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＯＶＡ?ｍＲＮＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｉｎ?ＭＣ３８?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??ｃｅｌｌｓ（ｎ＝３）．?＊?尸?＜０．０５

為了驗證ＯＶＡ基因表達(dá)情況，提取ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞總ＲＮＡ和膜蛋白，分??別通過ｑＲＴ－ＰＣＲ和ＷＢ從ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)水平檢測ＯＶＡ基因的表達(dá)。０ＶＡ－ＧＭＣ３８??細(xì)胞中ＯＶＡ表達(dá)水平高于未感染的ＭＣ３８細(xì)胞約６９倍（圖２．４）。ＷＢ方法檢測結(jié)??果顯示（圖２．５），作為陽性對照的Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細(xì)胞有明顯的ＯＶＡ表達(dá)（以膜蛋白??內(nèi)參Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度比值為０．７１），ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞中也有ＯＶＡ??表達(dá)（以膜蛋白內(nèi)參Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度比值為１．１１），而ＭＣ３８和空??病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（ＫＢ－ＭＣ３８）中無ＯＶＡ表達(dá)。上述實(shí)驗結(jié)果提示經(jīng)過篩選，獲得??了?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞的穩(wěn)定株。??１００－１???Ｉ?氺氺氺?Ｉ??屮?８０＿?１?＇??＾６０－?＿??？?４０－??Ｂ??２０－??０－＊?１?＊???ＭＣ３８?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??圖２．４?ＭＣ３８細(xì)胞、ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞ＯＶＡｍＲＮＡ表達(dá)水平??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＯＶＡ?ｍＲＮＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｉｎ?ＭＣ３８?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??ｃｅｌｌｓ（ｎ＝３）．?＊?尸?＜０．０５

與ＭＣ３８相比，ＯＶＡ－ＧＭＣ３８細(xì)胞致瘤能力沒有受基因轉(zhuǎn)染的影響，可以用于小鼠??結(jié)腸癌腫瘤模型的相關(guān)實(shí)驗，且致瘤率與未轉(zhuǎn)基因前一樣，都是１００％；腫瘤生長速??度二者也無統(tǒng)計學(xué)差異（圖２．６）。??Ａ?Ｂ??８００－１?ＭＣ３８?２２１?ＭＣ３８??§?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８?ｎｃ?ｎｓｊｆ?＾?＋?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??Ｊ＾ＯＯ－?＾２０－?Ａ??ｌ?４００＇??｜２：Ｚ?１６?，??４?６?８?１０?１２?１４?１６?１８?２０?２２?０?２?４?６?８?１０?１２?１４?１６?１８?２０?２２??時間（天）?時間（天）??圖２．６荷瘤小鼠的平均腫瘤體積和體重變化。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．６?Ｔｈｅ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ａｖｅｒａｇｅ?ｔｕｍｏｒ?ｖｏｌｕｍｅ?ａｎｄ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ｔｕｍｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ?ｍｉｃｅ．?Ｔｈｅ??ｄａｔａ?ｉｓ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｍｅａｎ?土?ＳＤ?（ｎ＝６）．?＊?Ｐ?＜?０．０５，?＊＊?尸?＜?０．０１，＊＊＊?Ｐ?＜?０．００１．??２．４．４?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８荷瘠小鼠的抗腫瘤免疫測試??為了進(jìn)一步驗證ＯＶＡ－ＧＭＣ３８用于腫瘤免疫的可行性，第０天，將ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??注射于小鼠的右側(cè)腹部皮下建立小鼠結(jié)腸癌模型，用ＯＶＡ免疫，第２１天剝離小鼠??腫瘤組織，如圖２．７?Ａ？Ｄ顯示ＯＶＡ免疫組腫瘤明顯小于ＰＢＳ組，實(shí)驗結(jié)果提示ＯＶＡ??免疫能明顯延緩ＯＶＡ－ＧＭＣ３８腫瘤的生長。與ＰＢＳ對照組相比，ＯＶＡ免疫后腫瘤??組織質(zhì)量顯著降低０＝３．５９０
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本文編號：2836355