背景肝細(xì)胞肝癌作為全世界發(fā)生率最高的腫瘤之一,在男性的惡性腫瘤發(fā)生率中排名第5位,在女性的惡性腫瘤發(fā)生率中排名第7位,死亡率高居世界第3位。大多數(shù)肝癌病例(80%)可歸因于乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染,這也解釋了 HCC的獨(dú)特地理分布,即大多數(shù)病例在發(fā)展中國(guó)家有地方性感染。而如何提高肝癌的早期診斷率,為患者提高根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)是當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題。甲胎蛋白是目前臨床實(shí)踐中常用的腫瘤學(xué)指標(biāo),聯(lián)合影像學(xué)檢查用于肝細(xì)胞癌的篩查、檢測(cè)。然而,一些研究表明AFP在早期肝癌診斷中的靈敏度低至22%到60%。因此,我們迫切需要尋找甲胎蛋白以外的有效的非侵入性腫瘤標(biāo)志物來(lái)協(xié)助診斷肝癌并指導(dǎo)個(gè)體化治療。DKK3基因是Dickkopf家族的成員,是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗因子之一,可與Wnt受體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合進(jìn)而選擇性抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。而拮抗基因表達(dá)的沉默會(huì)使其自身失去對(duì)通路的抑制作用,可導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限增殖,腫瘤形成。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)DKK3的下調(diào)或沉默與骨髓增生異常綜合征、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、AML啟動(dòng)子CpG島的甲基化有關(guān)。而且已有研究表明HCC組織中DKK3的異常啟動(dòng)子甲基化可能是HCC的重要機(jī)制。但肝癌組織獲取創(chuàng)傷性太大,有局限性。而肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取創(chuàng)傷性小,且尚未見(jiàn)報(bào)道肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3的甲基化狀態(tài)。ITIH5是ITI家族的一員,通過(guò)與透明質(zhì)酸的共價(jià)結(jié)合來(lái)維持ECM,即細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。目前已有較多研究表明,ITIH5在乳房癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中異常甲基化狀態(tài),可引起基因表達(dá)下調(diào)。而在腫瘤的形成過(guò)程中,ITIH5基因表達(dá)下調(diào)或沉默與腫瘤的轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展有關(guān)。但目前肝癌患者中ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化狀態(tài)及其潛在的作用仍是未知的。因此本研究的目的是研究肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化狀態(tài),以及其潛在診斷價(jià)值。研究方法在這項(xiàng)研究中,招募了 203名受試者,其中包括113名肝癌患者,60名慢性乙型肝炎患者和30名正常對(duì)照者。通過(guò)手工法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA、RNA,RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用MSP,即甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5的甲基化狀態(tài)。RT-qPCR,即實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5 的 mRNA 水平。結(jié)果1.HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞DKK3啟動(dòng)子甲基化率(73.45%,83/113)要明顯高于 CHB 組(38.33,23/60,P=0.000)和正常對(duì)照組(36.67,11/30,P=0.000)。CHB組與正常對(duì)照組之間的甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.878)。HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5啟動(dòng)子和第一外顯子甲基化率為75.22%(85/113),明顯高于 CHB 組(33.33,20/60,P=0.000)和正常對(duì)照組(30.00,9/30,P=0.000)。CHB組、正常對(duì)照組之間的甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.750)。2.HCC患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3 mRNA水平明顯低于CHB患者組(P=0.0020)和正常對(duì)照組(P0.0001)。CHB患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3 mRNA水平顯著低于正常對(duì)照組(P=0.0011)。HCC患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5 mRNA水平明顯低于慢乙肝患者組(P0.0001)和正常對(duì)照組(P0.0001)。CHB患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞ITIH5 mRNA水平顯著低于正常對(duì)照(P=0.0003)。HCC患者組中DKK3、ITIH5陽(yáng)性組mRNA水平分別低于DKK3陰性組(P=0.0005)、ITIH5 陰性組(P=0.0110)。3.腫瘤大小3cm的HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3甲基化率要明顯高于腫瘤大小≤3cm的HCC患者(X2=5.399,P=0.020),且腫瘤大小3cm的HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3 mRNA水平明顯低于腫瘤大小≤3cm的HCC患者組(P=0.0132)。HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化率與血管侵襲(X2=6.240,P=0.012)、TNM 分期(X2=5.034,P=0.025)相關(guān)。且ITIH5 mRNA水平與血管侵襲(P=0.0090)、TNM分期(P=0.0203)有關(guān)。4.外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3基因甲基化診斷HCC的敏感性為73.45%,ITIH5基因甲基化診斷HCC的敏感性為75.22%。DKK3甲基化、ITIH5甲基化聯(lián)合在診斷早期肝癌方面的敏感性為86.49%,明顯高于血清AFP(86.49%vs54.05%,P=0.002)。結(jié)論研究表明,外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5的甲基化可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。DKK3甲基化、ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)在肝癌診斷中的應(yīng)用明顯提高了肝癌早期診斷的敏感性,可能成為檢測(cè)早期肝癌和肝癌轉(zhuǎn)移的有效非侵入性腫瘤標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R735.7
【部分圖文】：

?（ＴＩＭＳ??圖２外周血單個(gè)核細(xì)胞ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５甲基化率在ＨＣＣ組、ＣＨＢ組、ＨＣ組比較??圖２?ａ?ＤＫＫ３啟動(dòng)子在ＨＣＣ組、ＣＨＢ組、丨Ｋ：組的甲基化狀態(tài)??ｂ?ＩＴＩＨ５啟動(dòng)子、第一外顯子在ＨＣＣ組、ＣＨＢ組、ＨＣ組的甲基化狀態(tài)。??ＨＣＣ，肝細(xì)胞癌；ＣＨＢ，慢性乙型病毒性肝炎；ＨＣ，健康對(duì)照。??３３??

圖３?ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物凝膠圖??ａ?ＤＫＫ３甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物凝膠圖??ｂ?ＩＴ１Ｈ５甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物凝膠圖??Ｍ，甲基化產(chǎn)物條帶；Ｕ，非甲基化產(chǎn)物條帶；ＨＣＣ，肝細(xì)胞癌；ＣＨＢ，慢性乙型病毒性肝炎；??ＨＣ，健康對(duì)照；ＷＢ，空白對(duì)照。??３４??

圖５外周血單個(gè)核細(xì)胞中ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５的甲基化狀態(tài)與定量因素之間相關(guān)性的研究??ａ?ＤＫＫ３的甲基化狀態(tài)與ＡＬＴ水平無(wú)相關(guān)性（Ｐ?＝?０．?４６４４）．?ｂ?ｃ?ＤＫＫ３的甲基化狀態(tài)與ＡＳＴ?（Ｐ??＝０？?４１４５）、ＡＬＢ?（Ｐ?＝?０？?９５０７）均無(wú)相關(guān)性．ｄ?ｅ?ＴＢＩＬ（Ｐ?＝?０？?１９２４）水平、ＰＴＡ?（Ｐ?＝?０？?９１４５）??在ＤＫＫ３甲基化組與非甲基化組之間未探索到相關(guān)性．ｆ?ＡＦＰ水平（（ｌｏｇ?１０?ｎｇ?ｐｅｒ?ｍＬ）??在ＤＫＫ３甲基化組與非甲基化組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ?＝?０．?８７３３）．?ｇ－１?ＡＬＴ水平（Ｐ＝０．?９５７９），??ＡＳＴ?水平?Ｔ（Ｐ＝０．?５５６９），?ＡＬＢ?水平（Ｐ＝０．?０９６１），?ＴＢＩＬ?水平（Ｐ＝０．?５１０６），?ＰＴＡ（Ｐ＝０．?４７７２）?ａｎｄ?ＡＦＰ??水平（ｌｏｇ?１０?ｎｇ?ｐｅｒ?ｍＬ，Ｐ＝０．?１８９０）在ＩＴＩＨＳ甲基化組、非甲基化組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．??ＡＬＴ，谷丙轉(zhuǎn)氨酶；ＡＳＴ，谷草轉(zhuǎn)氨酶；ＡＬＢ，血清白蛋白；ＴＢＩＬ，總膽紅素；ＰＴＡ，凝血酶原??活動(dòng)度；ＡＦＰ，甲胎蛋白。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2836197