錨蛋白重復(fù)序列ANK是蛋白數(shù)據(jù)庫中最常見的蛋白序列之一,在酵母和果蠅中首次確定的,具有33個(gè)氨基酸的序列重復(fù)12-24次。具有多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和一個(gè)單獨(dú)的KH結(jié)構(gòu)域的MASK蛋白是通過基因篩選的方法在果蠅中首次被發(fā)現(xiàn)的。MASK在人類中的的直系同源蛋白是ANKHD1(包含錨蛋白重復(fù)序列和一個(gè)KH結(jié)構(gòu)域),過去曾經(jīng)被命名為hMASK,于2003年是由Poulin等在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中發(fā)現(xiàn)的。ANKHD1蛋白的編碼基因位于人類5號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)。所含有的錨蛋白重復(fù)序列表明了ANKHD1作為骨架蛋白的作用,主要可以介導(dǎo)蛋白之間的相互作用,是細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、分化、凋亡和細(xì)胞骨架組織等生物學(xué)過程的基礎(chǔ)。KH結(jié)構(gòu)域主要可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用。ANKHD1(錨蛋白重復(fù)和KH結(jié)構(gòu)域包含蛋白1),是一種在正常人類組織中普遍表達(dá)的蛋白,并且在某些癌癥組織中高表達(dá)。ANKHD1主要位于細(xì)胞漿,也有研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核中也有表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),在正常造血細(xì)胞和急性白血病細(xì)胞中定位于胞漿,細(xì)胞核中未見表達(dá);在多發(fā)骨髓瘤的細(xì)胞系中胞漿和胞核中均有表達(dá)。因?yàn)槠鋵?duì)P21有直接的調(diào)節(jié)作用,研究者猜測(cè)其存在著胞漿和胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)揮作用,ANKHD1可以通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,影響腫瘤細(xì)胞的增殖。十余年來,逐漸有學(xué)者研究ANKHD1在疾病中的作用,包括在多發(fā)骨髓瘤、急性白血病和前列腺癌等細(xì)胞系的研究。另有研究發(fā)現(xiàn)ANKHD1在果蠅和人類的Hippo通路中YAP1的激活起到了非常重要的作用。在果蠅的S2細(xì)胞系的體外研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)沉默MASK的表達(dá)能夠特異性的減低Yki的活性,并且在果蠅中組織的正常生長(zhǎng)和Yki靶基因的表達(dá)是必要的。在體研究發(fā)現(xiàn),蛋白Mask可以和蛋白Yki形成復(fù)合物的形式而發(fā)揮作用。應(yīng)用探針的辦法在乳腺癌病人的基因表達(dá)數(shù)據(jù)文件中檢測(cè)MASK1mRNA的第一個(gè)錨蛋白重復(fù)序列,發(fā)現(xiàn)MASK1的表達(dá)水平較低的病人預(yù)后越好。后來又有學(xué)者在前列腺癌細(xì)胞系的研究中證明ANKHD1通過與YAP1結(jié)合,激活YAP1,通過調(diào)節(jié)CyclinA的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的進(jìn)展,沉默ANKHD1可以使得YAP1在mRNA和蛋白水平均下調(diào)。YAP1是Hippo信號(hào)通路的核效應(yīng)因子,編碼基因位在染色體11q13,其編碼Yes相關(guān)蛋白YAP,YAP為65kda的蛋白,由1至2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域、羧基末端的PDZ結(jié)合序列、氨基末端富脯氨酸結(jié)構(gòu)域、14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)及SH3結(jié)合基序構(gòu)成。Hippo信號(hào)通路可被各種不同的上游信號(hào)激活,包括G蛋白偶聯(lián)受體,細(xì)胞接觸、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞極性及細(xì)胞粘附分子或連接蛋白等。在人類中,重要的Hippo信號(hào)通路的分子有Yes-associated protein1(YAP1),Large tumor suppressors 1 and2(LATS1/2),MammalianSTE-20 kinases1and2(MST1/2)和Msp-one-binder(MOB1),這些分子是進(jìn)化保守的,并且在腫瘤的發(fā)生中起到抑制因子的作用。Hippo通路激活后,能夠依次磷酸化激酶MST1/2,LATS1/2,而后者可磷酸化YAP1,YAP1絲氨酸磷酸化導(dǎo)致了細(xì)胞漿的隔離和降解。失活后,非磷酸化狀態(tài)的YAP1激活,進(jìn)入細(xì)胞核。然后,YAP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用,能夠與各種不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合如:ErbB4,p53,BP-2,RUNX2,TEAD1-4和p73,進(jìn)而調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)、調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄活性,但其自身并沒有轉(zhuǎn)錄活性。目前的研究表明,ANKHD1在細(xì)胞功能相關(guān)的信號(hào)通路中可能有很多作用,如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞生存。至今,尚未有ANKHD1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響相關(guān)研究,本研究的目的旨在探索ANKHD1是否通過影響YAP的表達(dá)進(jìn)而影響Hippo通路的活性而影響非小細(xì)胞肺癌的惡性表型的。材料與方法一、患者信息和樣本本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院搜集170例(1999年-2006年)非小細(xì)胞肺癌及30例對(duì)應(yīng)的癌旁正常肺組織(距腫物邊界大于5cm)標(biāo)本,所有標(biāo)本來源的患者均接受肺癌手術(shù)但沒有接受過術(shù)前放化療治療,而且具有完整的隨訪資料,隨訪從手術(shù)之日起到隨訪結(jié)束日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡之日止。其中男性為94例,女性為76例。根據(jù)WHO2015肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)和2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新評(píng)估。二、Cell linesHBE細(xì)胞系從ATCC(Manassas,VA,USA)細(xì)胞庫獲得。LK2購買于JCRB細(xì)胞庫(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank),PG-LH7(LH7)、BE1是來自北京大學(xué)zheng jie教授的友好惠贈(zèng),A549、H1299、SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)購于上海細(xì)胞庫所有細(xì)胞系都用含10%的小牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及100U/mL的青鏈霉素(Sigma,St.Louis,MO,USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)并置于37°C,5%濃度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、免疫組織化學(xué)將選取的病理標(biāo)本的蠟塊制備成4微米厚的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水,抗原修復(fù)步驟后,染色采用S P系統(tǒng)(KIT-9710,Ultrasensitive TM S-P,MaiXin,China),利用ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164)抗體進(jìn)行染色�？瞻讓�(duì)照組以PBS代替一抗。生物素標(biāo)記的二抗(Ultrasensitive;MaiXin,Fuzhou,China)37℃孵育30分鐘,DAB顯色。在每張切片上,隨機(jī)選5個(gè)視野,每個(gè)視野都進(jìn)行計(jì)數(shù)約500個(gè)細(xì)胞。然后依據(jù)所計(jì)數(shù)的細(xì)胞著色的百分比,將表達(dá)ANKHD1的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行劃分,五個(gè)等級(jí)分別為:0分(無細(xì)胞著色),1分(1-25%的細(xì)胞著色),2分(26-50%的細(xì)胞著色),3分(51-75%的細(xì)胞著色),4分(76%以上的細(xì)胞著色)。依據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度,我們將ANKHD1的表達(dá)劃分成4個(gè)等級(jí):0分(無著色),1分(淺黃色顆粒),2分(黃色顆粒),3分(深黃色或者黃褐色顆粒)。每張切片的最終得分為:切片細(xì)胞數(shù)目等級(jí)評(píng)分與著色分?jǐn)?shù)等級(jí)評(píng)分的乘積。將得分小于2判為陰性,而將得分大于或等于2以上判為陽性。四、Western Blot應(yīng)用胰酶消化并收集培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中成指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞后,加入裂解液(Pierce,Rockford,IL,USA)進(jìn)行充分裂解,并利用超聲使蛋白裂解更完全,冰上靜置5分鐘,放入提前4℃預(yù)冷處理的離心機(jī)離心10分鐘,提取其總蛋白,然后用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行濃度測(cè)定,并定量,加入6Xloading buffer,沸水煮樣5分鐘。上樣,通過6%濃度的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳,電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將膜放入5%脫脂奶粉內(nèi)室溫?fù)u床封閉1小時(shí),加入ANKHD1(Abcam,ab1177881:500)LATS1(Cell Signaling Technology,#9153,1:1000);p-YAP(Cell Signaling Technology,#4911,1:1000);YAP(Cell Signaling Technology,#4912,1:1000);MST1(Cell Signaling Technology,#3682,1:1000/IB);CTGF(Santa Cruz Technology,sc-14940,1:100)GAPDH(Sigma#G8795;1:2000 IB);4℃過夜。分別加入山羊抗兔,或抗鼠的二抗(1:5000,Santa Cruz Biotechnology,Inc.CA,USA)后,37℃孵育1小時(shí)。TTBS洗膜后,ECL發(fā)光。五、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染干擾pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1質(zhì)粒購自O(shè)rigene公司(RC221886,Rockville,MD,USA)siRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073),shRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073-SH),將質(zhì)粒按照相關(guān)說明用Lipofectamine 3000Transfection Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),48h或72h后,利用Western blotting或?qū)崟r(shí)定量PCR的方法檢測(cè)相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)。六、免疫熒光實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定,Triton X-100打孔,用5%BSA室溫封閉1小時(shí)后,加入一抗ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164),4℃孵育過夜,次日加入山羊抗兔/鼠二抗、羅丹明二抗避光孵育。細(xì)胞核采用DAPI染色,甘油封片,采用Radiance 2000熒光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss,Thornwood,NY,USA)采集圖片。每一步染色之后均用PBS洗。七、MTT實(shí)驗(yàn)用胰酶消化轉(zhuǎn)染或干擾24小時(shí)后的細(xì)胞,并制成單細(xì)胞懸液后嗎,轉(zhuǎn)入96孔板,每一個(gè)孔約移入3000個(gè)左右細(xì)胞,隨后加入含10%的小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,每孔加入20微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液,保留只有培養(yǎng)液的對(duì)照孔。在37℃條件下,進(jìn)行避光孵育,4小時(shí)后棄掉原溶液,加入150微升的DMSO溶解生成的MTT結(jié)晶,用分光光度計(jì)檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的吸收峰值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,并取平均值。八、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)采用一個(gè)24孔板,含有8μm微孔的Transwell小室(Corning,NY,USA),上室鋪以雙無的1640培養(yǎng)基按1:3的比例稀釋的基質(zhì)膠(BD Biosciences)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,100微升約含有5×10~5個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含血清的上室,孵育16小時(shí),下室加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),將表面細(xì)胞用棉簽擦掉,將剩余細(xì)胞用預(yù)冷的4%甲醛固定,然后進(jìn)行蘇木素染色,1%鹽酸酒精分化,返藍(lán)10分鐘。在顯微鏡下進(jìn)行統(tǒng)計(jì),具體方法為,隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。九、集落形成實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染或干擾ANKHD1后的細(xì)胞,接種到6厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中(約1000個(gè)細(xì)胞/皿)孵育2周。用PBS洗滌后,吉姆薩染色、干燥,在顯微鏡下進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。十、RNA提取和Real-time PCR使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)從細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)PrimeScript~(TM) RT Master Mix(TaKaRa,China)實(shí)驗(yàn)說明書,1微克RNA用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。Real-time PCR采用使用總量為20微升體系的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)在7900實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA)中完成。運(yùn)行qRT-PCR反應(yīng)板熱循環(huán)反應(yīng)為50℃2min,95℃10min,95℃40s,40個(gè)循環(huán),然后60℃60s。GAPDH作為內(nèi)參,基因表達(dá)的倍數(shù)改變采用2~(-ΔΔCt)方法計(jì)算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)定量PCR引物序列為:ANKHD1:5-AGACCAATCGGAACACGGCTCT-35-CAGAAGCTGCTTCCATCAAGGG-3YAP1:5-TGTCCCAGATGAACGTCACAGC-35-TGGTGGCTGTTTCACTGGAGCA-3GAPDH:5-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-35-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3十一、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)首先用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩遍,用NP-40裂解液冰浴5分鐘后,將細(xì)胞裂解產(chǎn)物從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移至新的EP管中,裂解產(chǎn)物在4℃條件下,16000g離心5分鐘后,將上清轉(zhuǎn)移至新管中,紫外分光光度計(jì)將蛋白定量,提取約200ug蛋白,加入足夠量的抗體,4℃輕搖過夜,然后加入25 uL A/G蛋白磁珠(Beyotime,Jiangsu,China)4。C輕搖4h.然后將混合物1500×g 4。C離心5分鐘,然后將上清去掉。將上一步驟所余沉淀物,用冰浴的RIPA緩沖液洗3次,加入樣品緩沖液,在沸水中煮5min使免疫復(fù)合物與磁珠解離。然后收取免疫復(fù)合物進(jìn)行Western blot檢測(cè)。十二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)20只BALB/c裸小鼠,4-6周齡,雌性,18-21g,從北京維通利華公司購買。于溫度恒定,濕度恒定的半屏障系統(tǒng)中進(jìn)行飼養(yǎng),并且,裸鼠的飲用水和飼料都經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理。嚴(yán)格按照中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理?xiàng)l例,進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)施。實(shí)驗(yàn)共分為4組(5只/組):分別為穩(wěn)轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的A549細(xì)胞組,穩(wěn)轉(zhuǎn)pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1的A549細(xì)胞組,穩(wěn)轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的SPC細(xì)胞組,穩(wěn)轉(zhuǎn)shANKHD1的SPC細(xì)胞組,調(diào)整各組細(xì)胞濃度至5×10~6個(gè)/ml,于裸鼠背部皮下注射0.2ml。從注射細(xì)胞的當(dāng)天算起,進(jìn)行連續(xù)觀察,8周后統(tǒng)一處死,腫瘤稱重后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。十三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將所有獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS軟件19.0版本(SPSS,Chicago,IL,USA))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Chi-Square檢驗(yàn)ANKHD1表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。Kaplan-Meier法檢測(cè)ANKHD1對(duì)患者生存時(shí)間的影響。其他結(jié)果的比較均采用t檢驗(yàn)。p0.05則為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、ANKHD1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)1.在30例正常組織中,ANKHD1陽性表達(dá)為11例,陽性表達(dá)率為36.7%;陰性表達(dá)為19例,陰性表達(dá)率為63.3%。在170例非小細(xì)胞肺癌中,ANKHD1陽性表達(dá)為117例,陽性表達(dá)率為68.8%;陰性表達(dá)為53例,陰性表達(dá)率為31.2%.ANKHD1在肺癌中的表達(dá)明顯上調(diào)(p=0.004)2.8對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織進(jìn)行Western Blot分析,檢測(cè)ANKHD1蛋白表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)ANKHD1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。二、ANKHD1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征具有相關(guān)性ANKHD1的表達(dá)與患者年齡(p=0.615)性別(p=0.740)、組織學(xué)類型(p=0.743)、分化程度(p=0.188)和腫瘤大小(p=0.862)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系;但是,ANKHD1的陽性表達(dá)與高的p-TNM分期(p=0.019)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.020)有關(guān)。三、ANKHD1過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)1.生存分析結(jié)果顯示ANKHD1高表達(dá)的肺癌術(shù)后患者5年總體生存時(shí)間要低于ANKHD1陰性表達(dá)的患者(p=0.037),提示ANKHD1與患者預(yù)后相關(guān);2.應(yīng)用Cox線性回歸分析肺癌患者危險(xiǎn)因素,發(fā)現(xiàn)ANKHD1陽性表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(p0.05,表3)。四、ANKHD1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中發(fā)揮致癌因子作用在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,SPC,H1299,LK2,LTE,BE1,LH7中,與正常人支氣管上皮細(xì)胞系HBE相比,ANKHD1的mRNA和蛋白質(zhì)水平呈高表達(dá)。在ANKHD1表達(dá)相對(duì)較低水平的細(xì)胞系A(chǔ)549中轉(zhuǎn)染ANKHD1的質(zhì)粒,在ANKHD1表達(dá)相對(duì)較高水平的細(xì)胞系SPC中干擾ANKHD1;并在48或72小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)染和干擾效率。1.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1細(xì)胞克隆形成的數(shù)量顯著升高。(轉(zhuǎn)染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1與對(duì)照組相比:284±28 vs 140±20,p0.05))。在SPC細(xì)胞系中干擾ANKHD1的表達(dá)細(xì)胞克隆形成的數(shù)量顯著降低。(對(duì)照組與ANKHD1siRNA組相比:186±41 vs 103±16,p0.05)。2.MTT實(shí)驗(yàn):在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1與對(duì)照組相比,增殖率增加;在SPC細(xì)胞系中干擾ANKHD1的表達(dá),與對(duì)照組相比,增殖率降低。3.侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549轉(zhuǎn)染ANKHD1后侵襲細(xì)胞數(shù)相比于對(duì)照組明顯增加(轉(zhuǎn)染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1組vs對(duì)照組:134±5 vs 43±6,p0.05);肺癌細(xì)胞系SPC干擾ANKHD1后侵襲細(xì)胞數(shù)相比于對(duì)照組明顯減少(對(duì)照組vs ANKHD1siRNA組:160±10 vs 61±6,p0.05)五、ANKHD1表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)裸鼠移植瘤的形成裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示在A549中轉(zhuǎn)染ANKHD1,相比于對(duì)照組,腫瘤的重量顯著增加(shRNA-ANKHD1 vs對(duì)照組:0.798±0.068 vs 0.330±0.052,p0.05);在SPC中干擾ANKHD1與對(duì)照組相比,腫瘤的質(zhì)量降低顯著(對(duì)照組vs siRNA-ANKHD1:0.712±0.062 vs 0.290±0.067,p0.05)。六、ANKHD1能夠影響Hippo下游靶基因CyclinD1和CTGF的表達(dá)轉(zhuǎn)染和干擾ANKHD1后對(duì)HIPPO靶基因表達(dá)的影響在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染ANKHD1后,CTGF及Cyclin D1的表達(dá)上調(diào);在SPC細(xì)胞系中干擾ANKHD1,CTGF及Cyclin D1的表達(dá)下調(diào)。七、ANKHD1通過調(diào)控YAP1的表達(dá)影響Hippo通路的活性1.ANKHD1、YAP1在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有定位,ANKHD1主要定位于胞漿,YAP1定位于細(xì)胞核。2.ANKHD1與YAP1結(jié)合,并促進(jìn)YAP1mRNA及蛋白水平的上調(diào)。3.在H1299細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1、空質(zhì)粒與siYAP、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1與siYAP,分別行克隆形成實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:ANKHD1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:84±4 vs 180±9,p0.001),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:43±7 vs 56±5,p0.05)和侵襲(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:68±4 vs 134±6,p0.05),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:28±2 vs 34±2,p0.05),且這種作用是通過YAP實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論1.ANKHD1在人類非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)上調(diào),并與p-TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有顯著的相關(guān)性2.ANKHD1能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲。3.ANKHD1能夠影響Hippo通路下游靶基因的表達(dá)。4.ANKHD1通過調(diào)控YAP1及其磷酸化影響Hippo通路的活性促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

圖 1 ANKHD1 在肺癌組織和癌旁肺組織的表達(dá)和定位（400×）A. ANKHD1 在支氣管上皮陰性表達(dá)B. ANKHD1 在肺泡上皮陰性表達(dá)C. ANKHD1 在肺腺癌組織胞漿陽性表達(dá)D. ANKHD1 在肺鱗癌組織胞漿陽性表達(dá)表 1 ANKHD1 在肺癌組織的陽性表達(dá)率高于癌旁肺組織的表達(dá)* p<0.05, indicate statistical significance3.1.2 我們又進(jìn)一步采用 8 對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織進(jìn)行Western Blot 分析，檢測(cè) ANKHD1 蛋白表達(dá)情況。其結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致NANKHD1P-valueNegative PositiveNormal 3019 (63.3%) 11 (36.7%)0.004Tumor 17053 (31.2%) 117(68.8%)

圖 2 ANKHD1 在肺癌組織和癌旁正常肺組織的蛋白表達(dá)情1 的表達(dá)與肺癌臨床病理特征具有相關(guān)性究 ANKHD1 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)上調(diào)是否具有達(dá)情況與臨床病理因素之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系。結(jié)果表明：A TNM 分期（p=0.019）和陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（p=0.020）呈.615）性別（p=0.740）、組織學(xué)類型（p=0.743）、分化程p=0.862）并無明顯相關(guān)性（表 2）。

非小細(xì)胞肺癌患者 ANKHD1 陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患o(jì)x 線性回歸分析肺癌患者危險(xiǎn)因素，發(fā)現(xiàn) AN肺癌患者的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。（表 3）表 3 Cox regression model 分析肺癌患者危險(xiǎn)因athological Hazard ratiocteristics (95% CI)ate analysiser than 55 0.929 (0.652-1.323) er: male 0.941 (0.665-1.331) e : Adenocarcinoma 1.238 (0.875-1.752) ferentiation 1.155 (0.786-1.697) classification 0.993 (0.701-1.406) h node metastasis 1.797 (1.271-2.540) HD1 expression 1.698 (1.149-2.509) iate analysis

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊勇坡;;電視胸腔鏡肺葉切除術(shù)治療Ⅰ～Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌[J];深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志;2019年01期

2 葛會(huì)景;郭占林;;非小細(xì)胞肺癌術(shù)后預(yù)后相關(guān)因素的研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2018年06期

3 黃海欣;李桂生;黃東寧;陳紹俊;;多西他賽聯(lián)合奧沙利鉑治療33例老年晚期非小細(xì)胞肺癌[J];柳州醫(yī)學(xué);2009年01期

4 金冬春;裴俊烽;張前進(jìn);繆炳良;竺科英;;多西他賽聯(lián)合順鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌效果觀察[J];中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥;2018年23期

5 賀家勇;楊晨晨;徐茜;;微小RNA-221在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2018年32期

6 吳疇斌;方志明;王煒;郝名浩;;泛素特異性蛋白酶9X在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及與患者預(yù)后的關(guān)系[J];癌癥進(jìn)展;2018年12期

7 栗景坤;李習(xí);劉美娜;;基于評(píng)價(jià)指標(biāo)的非小細(xì)胞肺癌治療質(zhì)量影響因素分析[J];中國(guó)醫(yī)院統(tǒng)計(jì);2018年06期

8 黃賽男;姚紅艷;;中西醫(yī)結(jié)合治療非小細(xì)胞肺癌的研究進(jìn)展[J];湖南中醫(yī)雜志;2017年11期

9 湯麗云;;探討特羅凱治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床療效[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2017年91期

10 李嘉;溫本;鄭文滔;倪薇薇;;加速超分割放療與常規(guī)放療治療非小細(xì)胞肺癌的近期療效比較[J];臨床醫(yī)學(xué)工程;2017年12期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李天女;丁重陽;;非小細(xì)胞肺癌隱匿性淋巴結(jié)的危險(xiǎn)因素分析[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)影像專業(yè)委員會(huì)第十五次全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)暨上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)影像專業(yè)委員會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)暨《醫(yī)學(xué)影像新技術(shù)的臨床應(yīng)用》國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2017年

2 陳艷;王熙才;周永春;伍治平;金從國(guó);劉馨;姚乾;胡紅艷;徐瓏峰;田愛;;人非小細(xì)胞肺癌原位動(dòng)物模型的構(gòu)建及生物學(xué)特性比較研究[A];全國(guó)腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2015年

3 王明慧;肖汀;;熱休克蛋白90β在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[A];全國(guó)腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2015年

4 江一鳴;楊新妹;俞丹璐;王燕;;非小細(xì)胞肺癌循環(huán)內(nèi)皮干細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義[A];2014年浙江省內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)青年醫(yī)師論壇暨內(nèi)科常見病規(guī)范化診療國(guó)家級(jí)學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2014年

5 王子平;;老年晚期非小細(xì)胞肺癌治療思考[A];第三屆中國(guó)腫瘤內(nèi)科大會(huì)教育集暨論文集[C];2009年

6 張沂平;;非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化化療[A];2009年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)年會(huì)暨腫瘤診治新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

7 杜開齊;朱有才;張志豪;鄔冬強(qiáng);肖懷清;王細(xì)勇;;EGFR在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[A];2009年浙江省胸心外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

8 仝戰(zhàn)旗;吳整軍;郝愛真;;非小細(xì)胞肺癌患者長(zhǎng)期存活原因剖析[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科第十二次肺系病學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文集[C];2006年

9 賈小力;陳崗;;中國(guó)人非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體突變的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

10 張杰;;9345例手術(shù)切除非小細(xì)胞肺癌病理學(xué)回顧性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 李潔尉　通訊員 朱丹萍;非小細(xì)胞肺癌相關(guān)藥物研究獲進(jìn)展[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2012年

2 記者 安慧娟;治療非小細(xì)胞肺癌新藥鹽酸安羅替尼膠囊獲批上市[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2018年

3 本報(bào)記者 劉卉;非小細(xì)胞肺癌療法趨精準(zhǔn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2016年

4 趙舒;臨床三足鼎立成型[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2016年

5 張?jiān)?AURA3研究獲得非小細(xì)胞肺癌靶向治療新證據(jù)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2017年

6 本報(bào)記者 許寧生;阿法替尼賽點(diǎn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2017年

7 Simon King 編譯 廖聯(lián)明;今年這些藥物聚焦全球目光[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2017年

8 記者 廖晨霞;非小細(xì)胞肺癌特定藥納入醫(yī)保[N];天津日?qǐng)?bào);2017年

9 塔娜;非小細(xì)胞肺癌患者獲靶向藥援助[N];健康報(bào);2017年

10 記者 馮衛(wèi)東;加評(píng)估晚期非小細(xì)胞肺癌治療現(xiàn)狀[N];科技日?qǐng)?bào);2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 許晶;不可逆性EGFR-TKIs在非小細(xì)胞肺癌中獲得性耐藥機(jī)制的體外研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2018年

2 吳晶晶;轉(zhuǎn)錄因子ZNF326調(diào)控ERCC1表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

3 張松;miR-153靶向抑制SRC對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

4 惠林萍;CBLL1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

5 張洪巖;LINC00222通過調(diào)控GSK-3β影響非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

6 劉曉芳;ANKHD1通過調(diào)控YAP1及其磷酸化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

7 吳卓;ABCE1基因上調(diào)通過CCL7/受體途徑對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲能力的影響及作用機(jī)制的初步研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

8 肖玉波;8-十六烷基小檗堿抗肺癌作用及其機(jī)制研究[D];西南大學(xué);2018年

9 侯沙沙;S100A4在非小細(xì)胞肺癌腫瘤生長(zhǎng)和肥胖癥中的作用及分子機(jī)制研究[D];北京交通大學(xué);2018年

10 焦晶華;咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陸永濤;MNK1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

2 程序;非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中EpCAM及CK19的檢測(cè)及意義[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2018年

3 高飛;老年晚期非小細(xì)胞肺癌的證型特點(diǎn)及用藥規(guī)律[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 樊佳琪;284例非小細(xì)胞肺癌寒熱燥濕病性要素的臨床研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2018年

5 李玉成;基于非小細(xì)胞肺癌立體定向放療乾區(qū)外放的研究[D];南華大學(xué);2018年

6 李姝炎;早期非小細(xì)胞肺癌立體定向放療進(jìn)展[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

7 王冠;2型糖尿病對(duì)接受根治性手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響及與IGF-1R和HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

8 馮靜;長(zhǎng)非編碼RNA-IRAIN在非小細(xì)胞肺癌中的作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

9 汪程慧;miR-21在非小細(xì)胞肺癌中預(yù)后作用的薈萃分析[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2018年

10 謝雪婷;非小細(xì)胞肺癌EGFR陽性患者CT征象及其臨床特征研究[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2018年

本文編號(hào)：2832427