背景:惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康,治療惡性腫瘤是目前迫切需要解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。目前,過(guò)繼性免疫治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療、中醫(yī)中藥治療之外一種新的惡性腫瘤治療方法�；谇逗峡乖荏w(chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞的過(guò)繼性免疫治療是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。由基因工程技術(shù)構(gòu)建的CAR T細(xì)胞表面帶有識(shí)別腫瘤特異性抗原的受體,可不經(jīng)抗原提呈直接提供細(xì)胞活化信號(hào),不受主要組織相容性復(fù)合物限制,能實(shí)現(xiàn)良好的腫瘤靶向性和細(xì)胞活性,發(fā)揮強(qiáng)效的抗腫瘤作用。CAR T細(xì)胞療法在血液腫瘤治療中取得了巨大成功,2017年經(jīng)FDA批準(zhǔn)已有兩個(gè)CAR T細(xì)胞類藥物上市,用于急性淋巴細(xì)胞白血病和特定類型非霍奇金淋巴瘤患者治療。但CAR T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的研究目前進(jìn)展緩慢。實(shí)體瘤復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的免疫抑制是影響CAR T細(xì)胞療效的主要因素。因此,從打破腫瘤微環(huán)境免疫抑制的角度,尋找更合適的腫瘤特異性抗原、更合適的抗體,以提高CAR T細(xì)胞的抗實(shí)體瘤療效,具有重大的臨床意義。纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)是活化的成纖維細(xì)胞胞膜上面一種Ⅱ型膜整合糖蛋白,高度特異性表達(dá)于絕大多數(shù)惡性腫瘤微環(huán)境中增生性的成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAF),是CAF的特異性標(biāo)志物之一。FAP具有特殊的生物學(xué)特性,在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫抑制中均扮演了重要角色。以FAP作為靶點(diǎn)針對(duì)腫瘤間質(zhì)治療實(shí)體瘤的免疫治療正越來(lái)越受到關(guān)注。納米抗體是由駱駝血液中發(fā)現(xiàn)的重鏈抗體的可變區(qū)組成的一類單域抗體,具有高水溶性、高穩(wěn)定性、高表達(dá)性、高產(chǎn)量、較強(qiáng)的組織穿透性和較弱的免疫原性等優(yōu)點(diǎn),在惡性腫瘤免疫靶向治療方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。本課題組前期研究成功篩選出FAP特異性納米抗體,命名為F578。該納米抗體能與腫瘤細(xì)胞表面抗原FAP分子特異性性結(jié)合,能否應(yīng)用于構(gòu)建CAR T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用仍需進(jìn)一步研究。目的:探索應(yīng)用抗FAP納米抗體構(gòu)建CAR T細(xì)胞的方法,驗(yàn)證FAP-CAR T細(xì)胞的體外增殖活性和對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷作用,以及體內(nèi)對(duì)小鼠皮下肝癌移植瘤的抑制作用,初步探討FAP-CAR T細(xì)胞抗腫瘤作用及機(jī)制,為CAR T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤提供新的依據(jù)。方法:1.設(shè)計(jì)CAR基因序列,分別為Mock、CD19-CAR和FAP-CAR 3組;雙酶切方案切割PLVX慢病毒載體,完成目的基因與載體質(zhì)粒連接;進(jìn)行慢病毒的包裝和濃縮,以熒光計(jì)數(shù)法計(jì)算慢病毒滴度。2.分離培養(yǎng)人外周血T淋巴細(xì)胞,將收獲的慢病毒應(yīng)用于T細(xì)胞感染以完成CAR T細(xì)胞構(gòu)建;熒光顯微鏡觀察CAR T細(xì)胞的GFP表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR T細(xì)胞表達(dá)GFP的比例和CD4~+/CD8~+比例。3.收集人原發(fā)性肝癌組織,以消化差異法分離純化肝癌組織中的CAF,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FAP/α-SMA表達(dá)對(duì)CAF進(jìn)行鑒定。4.以未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞(Utd)為對(duì)照,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Utd組、Mock組、CD19-CAR組、和FAP-CAR組的CAR T細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后的增殖情況;以及表面活化分子CD25、CD69,記憶分子CD62L,溶酶體蛋白CD107a和胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FAP-CAR T細(xì)胞對(duì)FAP~+細(xì)胞系的體外殺傷情況;ELISA法檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10)的含量。6.構(gòu)建HepG2-hFAP細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型,隨機(jī)分為PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR組。經(jīng)尾靜脈分別注射各組CAR T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,觀察CAR T細(xì)胞治療對(duì)小鼠腫瘤的腫瘤體積、瘤重、以及小鼠存活時(shí)間的影響。7.腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到15 mm時(shí),處死小鼠剝離腫瘤并制備石蠟切片。免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織的Ki-67抗原和FAP表達(dá);TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的數(shù)量;免疫熒光法檢測(cè)腫瘤中的血管密度(CD34)。8.構(gòu)建HepG2-hFAP細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型,隨機(jī)分為PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR組。經(jīng)尾靜脈分別注射各組CAR T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組第7、第14、第28天荷瘤小鼠外周血、脾臟、腫瘤組織中人CD3的表達(dá)情況。9.取正常的NOD/SCID小鼠,分為FAP-CAR T組和PBS組。經(jīng)尾靜脈注射FAP-CAR T細(xì)胞治療后,HE染色法檢測(cè)其對(duì)小鼠主要臟器的毒性作用。結(jié)果:1.應(yīng)用雙酶切方案成功完成PLVX慢病毒載體切割和基因重組,PCR法驗(yàn)證各組CAR基因均可成功插入載體;重組載體包裝成慢病毒并濃縮后,最終收獲的慢病毒滴度滴度達(dá)到2E+8TU/ml;2.將這些慢病毒應(yīng)用于T細(xì)胞感染后,熒光顯微鏡下觀察到GFP熒光,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到各組細(xì)胞的GFP表達(dá)均超過(guò)了40%,表明CAR T細(xì)胞制備成功。3.流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離純化后的CAF進(jìn)行檢測(cè),FAP/α-SMA雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例達(dá)到75.7%,提示CAF分離成功,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。4.FAP-CAR T細(xì)胞經(jīng)FAP~+靶細(xì)胞刺激后增殖活躍,增殖頻率與倍數(shù)均明顯高于其余對(duì)照組別;其細(xì)胞表面活化分子CD25、CD69,記憶分子CD62L,溶酶體蛋白CD107a和胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)較其余對(duì)照組別均出現(xiàn)明顯上調(diào)。5.FAP-CAR T細(xì)胞可在體外明顯殺傷FAP~+的靶細(xì)胞,并且其殺傷效果隨著效靶比的升高而增強(qiáng),對(duì)高表達(dá)FAP的CAF和HepG2-hFAP靶細(xì)胞殺傷比例高于低表達(dá)FAP的U87細(xì)胞,對(duì)FAP~-的腫瘤細(xì)胞則沒(méi)有殺傷作用。當(dāng)與FAP~+靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),FAP-CAR T細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的含量明顯升高,IL-10的含量沒(méi)有明顯變化。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到FAP-CAR T細(xì)胞治療可明顯抑制HepG2-hFAP皮下移植瘤小鼠的腫瘤發(fā)展,并延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間、提高存活率;免疫組化法檢測(cè)到小鼠腫瘤組織表達(dá)Ki-67和FAP的細(xì)胞比例明顯降低;TUNEL法檢測(cè)到小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞比例明顯增加;免疫熒光法檢測(cè)到小鼠腫瘤的血管密度明顯降低。7.FAP-CAR組小鼠的外周血、脾臟和腫瘤組織中CD3表達(dá)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于其余對(duì)照組,在第14天時(shí)檢測(cè)到CD3表達(dá)上升至峰值,到第28天時(shí)仍能保持一定表達(dá)。8.HE染色法結(jié)果顯示FAP-CAR T細(xì)胞治療對(duì)小鼠的主要臟器無(wú)毒性作用。結(jié)論:基于抗FAP納米抗體構(gòu)建的FAP-CAR T細(xì)胞可在體內(nèi)外特異性靶向殺傷FAP~+靶細(xì)胞,這種針對(duì)腫瘤微環(huán)境的CAR T細(xì)胞療法為實(shí)體瘤的免疫治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

圖 1 納米抗體的結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of the antibody納米抗體本身屬于完整的抗原結(jié)合單位，相對(duì)于傳統(tǒng)抗體，它能識(shí)別更多的抗原表位，對(duì)靶標(biāo)抗原的識(shí)別能力更強(qiáng)，理論上用于構(gòu)建 CAR T 細(xì)胞時(shí)會(huì)具有更佳的靶向性，在腫瘤負(fù)荷降低或消退時(shí)仍能保持靶點(diǎn)識(shí)別；同時(shí)納米抗體具有特異性強(qiáng)、分子量小、穿透能力強(qiáng)以及免疫原性低的特性，在避免細(xì)胞因子風(fēng)暴和脫靶效應(yīng)方面可能更有優(yōu)勢(shì)。將納米抗體的這些優(yōu)點(diǎn)與 CAR T 細(xì)胞療法相結(jié)合，創(chuàng)建一種新的 CAR T 細(xì)胞構(gòu)建體系，相對(duì)于傳統(tǒng) CAR T 細(xì)胞療法可能是一種補(bǔ)充，也可能在實(shí)體腫瘤治療方面形成新的突破口。在前期研究中，我們應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選了一種 FAP 特異性的納

63圖 2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PLVX 慢病毒載體的酶切效率。(A) CAR 結(jié)構(gòu)圖。（B）PLVX 載體結(jié)構(gòu)圖。（C）PLVX 載體的凝膠電泳圖。M: 10000bp Marker。1：未酶切載體。2：酶切后載體。Figure 2 Agarose gel electrophoresis was used to detect the enzyme digestion efficiency of PLVXLentivirus vector.（A）The structure of CAR.（B）The structure of PLVX vector. （C）Gel electrophoresisanalysis of PLVX Vectors. M: 10000bp Marker. 1: Unenzymed vector. 2: Enzymatically digested vector.

轉(zhuǎn)染后的 293T 細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯綠色熒光（GFP）（圖4）。收集細(xì)胞上清，進(jìn)一步濃縮純化，最終 Mock 組、CD19-CAR 組和FAP-CAR 組均獲得高質(zhì)量的慢病毒，病毒滴度達(dá)到 2E+8TU/ml。圖 4 慢病毒感染的 293T 細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。400（×）Figure 4 The fluorescence from 293T cells was observed under fluorescence microscope. 400（×）

【參考文獻(xiàn)】

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1 任春霞;徐娜;宋亞琴;趙敏;陳亞萍;呂蓓;楊恭;;癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過(guò)Gro-α激活NF-кB核轉(zhuǎn)位和VEGF表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的生長(zhǎng)[J];中國(guó)癌癥雜志;2014年05期

2 申蓉,李麗珍;CD69與免疫功能的調(diào)節(jié)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2004年01期

本文編號(hào)：2831289