背景:惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康,治療惡性腫瘤是目前迫切需要解決的醫(yī)學(xué)問題。目前,過繼性免疫治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療、中醫(yī)中藥治療之外一種新的惡性腫瘤治療方法�；谇逗峡乖荏w(chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞的過繼性免疫治療是當(dāng)前研究的熱點。由基因工程技術(shù)構(gòu)建的CAR T細(xì)胞表面帶有識別腫瘤特異性抗原的受體,可不經(jīng)抗原提呈直接提供細(xì)胞活化信號,不受主要組織相容性復(fù)合物限制,能實現(xiàn)良好的腫瘤靶向性和細(xì)胞活性,發(fā)揮強效的抗腫瘤作用。CAR T細(xì)胞療法在血液腫瘤治療中取得了巨大成功,2017年經(jīng)FDA批準(zhǔn)已有兩個CAR T細(xì)胞類藥物上市,用于急性淋巴細(xì)胞白血病和特定類型非霍奇金淋巴瘤患者治療。但CAR T細(xì)胞治療實體腫瘤的研究目前進展緩慢。實體瘤復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的免疫抑制是影響CAR T細(xì)胞療效的主要因素。因此,從打破腫瘤微環(huán)境免疫抑制的角度,尋找更合適的腫瘤特異性抗原、更合適的抗體,以提高CAR T細(xì)胞的抗實體瘤療效,具有重大的臨床意義。纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)是活化的成纖維細(xì)胞胞膜上面一種Ⅱ型膜整合糖蛋白,高度特異性表達于絕大多數(shù)惡性腫瘤微環(huán)境中增生性的成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAF),是CAF的特異性標(biāo)志物之一。FAP具有特殊的生物學(xué)特性,在促進腫瘤生長、浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫抑制中均扮演了重要角色。以FAP作為靶點針對腫瘤間質(zhì)治療實體瘤的免疫治療正越來越受到關(guān)注。納米抗體是由駱駝血液中發(fā)現(xiàn)的重鏈抗體的可變區(qū)組成的一類單域抗體,具有高水溶性、高穩(wěn)定性、高表達性、高產(chǎn)量、較強的組織穿透性和較弱的免疫原性等優(yōu)點,在惡性腫瘤免疫靶向治療方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。本課題組前期研究成功篩選出FAP特異性納米抗體,命名為F578。該納米抗體能與腫瘤細(xì)胞表面抗原FAP分子特異性性結(jié)合,能否應(yīng)用于構(gòu)建CAR T細(xì)胞實現(xiàn)抗腫瘤作用仍需進一步研究。目的:探索應(yīng)用抗FAP納米抗體構(gòu)建CAR T細(xì)胞的方法,驗證FAP-CAR T細(xì)胞的體外增殖活性和對靶細(xì)胞的特異性殺傷作用,以及體內(nèi)對小鼠皮下肝癌移植瘤的抑制作用,初步探討FAP-CAR T細(xì)胞抗腫瘤作用及機制,為CAR T細(xì)胞治療實體腫瘤提供新的依據(jù)。方法:1.設(shè)計CAR基因序列,分別為Mock、CD19-CAR和FAP-CAR 3組;雙酶切方案切割PLVX慢病毒載體,完成目的基因與載體質(zhì)粒連接;進行慢病毒的包裝和濃縮,以熒光計數(shù)法計算慢病毒滴度。2.分離培養(yǎng)人外周血T淋巴細(xì)胞,將收獲的慢病毒應(yīng)用于T細(xì)胞感染以完成CAR T細(xì)胞構(gòu)建;熒光顯微鏡觀察CAR T細(xì)胞的GFP表達情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR T細(xì)胞表達GFP的比例和CD4~+/CD8~+比例。3.收集人原發(fā)性肝癌組織,以消化差異法分離純化肝癌組織中的CAF,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FAP/α-SMA表達對CAF進行鑒定。4.以未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞(Utd)為對照,流式細(xì)胞術(shù)檢測Utd組、Mock組、CD19-CAR組、和FAP-CAR組的CAR T細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后的增殖情況;以及表面活化分子CD25、CD69,記憶分子CD62L,溶酶體蛋白CD107a和胞內(nèi)IFN-γ的表達。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測FAP-CAR T細(xì)胞對FAP~+細(xì)胞系的體外殺傷情況;ELISA法檢測上清液中的細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10)的含量。6.構(gòu)建HepG2-hFAP細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型,隨機分為PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR組。經(jīng)尾靜脈分別注射各組CAR T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,觀察CAR T細(xì)胞治療對小鼠腫瘤的腫瘤體積、瘤重、以及小鼠存活時間的影響。7.腫瘤長徑達到15 mm時,處死小鼠剝離腫瘤并制備石蠟切片。免疫組化法檢測腫瘤組織的Ki-67抗原和FAP表達;TUNEL法檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的數(shù)量;免疫熒光法檢測腫瘤中的血管密度(CD34)。8.構(gòu)建HepG2-hFAP細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型,隨機分為PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR組。經(jīng)尾靜脈分別注射各組CAR T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組第7、第14、第28天荷瘤小鼠外周血、脾臟、腫瘤組織中人CD3的表達情況。9.取正常的NOD/SCID小鼠,分為FAP-CAR T組和PBS組。經(jīng)尾靜脈注射FAP-CAR T細(xì)胞治療后,HE染色法檢測其對小鼠主要臟器的毒性作用。結(jié)果:1.應(yīng)用雙酶切方案成功完成PLVX慢病毒載體切割和基因重組,PCR法驗證各組CAR基因均可成功插入載體;重組載體包裝成慢病毒并濃縮后,最終收獲的慢病毒滴度滴度達到2E+8TU/ml;2.將這些慢病毒應(yīng)用于T細(xì)胞感染后,熒光顯微鏡下觀察到GFP熒光,流式細(xì)胞術(shù)檢測到各組細(xì)胞的GFP表達均超過了40%,表明CAR T細(xì)胞制備成功。3.流式細(xì)胞術(shù)對分離純化后的CAF進行檢測,FAP/α-SMA雙陽性的細(xì)胞比例達到75.7%,提示CAF分離成功,可用于下一步實驗。4.FAP-CAR T細(xì)胞經(jīng)FAP~+靶細(xì)胞刺激后增殖活躍,增殖頻率與倍數(shù)均明顯高于其余對照組別;其細(xì)胞表面活化分子CD25、CD69,記憶分子CD62L,溶酶體蛋白CD107a和胞內(nèi)IFN-γ表達較其余對照組別均出現(xiàn)明顯上調(diào)。5.FAP-CAR T細(xì)胞可在體外明顯殺傷FAP~+的靶細(xì)胞,并且其殺傷效果隨著效靶比的升高而增強,對高表達FAP的CAF和HepG2-hFAP靶細(xì)胞殺傷比例高于低表達FAP的U87細(xì)胞,對FAP~-的腫瘤細(xì)胞則沒有殺傷作用。當(dāng)與FAP~+靶細(xì)胞共培養(yǎng)時,FAP-CAR T細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的含量明顯升高,IL-10的含量沒有明顯變化。6.體內(nèi)實驗觀察到FAP-CAR T細(xì)胞治療可明顯抑制HepG2-hFAP皮下移植瘤小鼠的腫瘤發(fā)展,并延長小鼠的生存時間、提高存活率;免疫組化法檢測到小鼠腫瘤組織表達Ki-67和FAP的細(xì)胞比例明顯降低;TUNEL法檢測到小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞比例明顯增加;免疫熒光法檢測到小鼠腫瘤的血管密度明顯降低。7.FAP-CAR組小鼠的外周血、脾臟和腫瘤組織中CD3表達在三個時間點均明顯高于其余對照組,在第14天時檢測到CD3表達上升至峰值,到第28天時仍能保持一定表達。8.HE染色法結(jié)果顯示FAP-CAR T細(xì)胞治療對小鼠的主要臟器無毒性作用。結(jié)論:基于抗FAP納米抗體構(gòu)建的FAP-CAR T細(xì)胞可在體內(nèi)外特異性靶向殺傷FAP~+靶細(xì)胞,這種針對腫瘤微環(huán)境的CAR T細(xì)胞療法為實體瘤的免疫治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

圖 1 納米抗體的結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of the antibody納米抗體本身屬于完整的抗原結(jié)合單位，相對于傳統(tǒng)抗體，它能識別更多的抗原表位，對靶標(biāo)抗原的識別能力更強，理論上用于構(gòu)建 CAR T 細(xì)胞時會具有更佳的靶向性，在腫瘤負(fù)荷降低或消退時仍能保持靶點識別；同時納米抗體具有特異性強、分子量小、穿透能力強以及免疫原性低的特性，在避免細(xì)胞因子風(fēng)暴和脫靶效應(yīng)方面可能更有優(yōu)勢。將納米抗體的這些優(yōu)點與 CAR T 細(xì)胞療法相結(jié)合，創(chuàng)建一種新的 CAR T 細(xì)胞構(gòu)建體系，相對于傳統(tǒng) CAR T 細(xì)胞療法可能是一種補充，也可能在實體腫瘤治療方面形成新的突破口。在前期研究中，我們應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選了一種 FAP 特異性的納

63圖 2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PLVX 慢病毒載體的酶切效率。(A) CAR 結(jié)構(gòu)圖。（B）PLVX 載體結(jié)構(gòu)圖。（C）PLVX 載體的凝膠電泳圖。M: 10000bp Marker。1：未酶切載體。2：酶切后載體。Figure 2 Agarose gel electrophoresis was used to detect the enzyme digestion efficiency of PLVXLentivirus vector.（A）The structure of CAR.（B）The structure of PLVX vector. （C）Gel electrophoresisanalysis of PLVX Vectors. M: 10000bp Marker. 1: Unenzymed vector. 2: Enzymatically digested vector.

轉(zhuǎn)染后的 293T 細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯綠色熒光（GFP）（圖4）。收集細(xì)胞上清，進一步濃縮純化，最終 Mock 組、CD19-CAR 組和FAP-CAR 組均獲得高質(zhì)量的慢病毒，病毒滴度達到 2E+8TU/ml。圖 4 慢病毒感染的 293T 細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。400（×）Figure 4 The fluorescence from 293T cells was observed under fluorescence microscope. 400（×）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 任春霞;徐娜;宋亞琴;趙敏;陳亞萍;呂蓓;楊恭;;癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過Gro-α激活NF-кB核轉(zhuǎn)位和VEGF表達促進卵巢癌的生長[J];中國癌癥雜志;2014年05期

2 申蓉,李麗珍;CD69與免疫功能的調(diào)節(jié)[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2004年01期

本文編號：2831289