目的:宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,是導(dǎo)致女性死亡的第二大癌癥。但是,目前主要采用放、化療治療中、晚期宮頸癌,無法降低患者的死亡率,且其無法避免的毒副作用大大降低了患者的生活質(zhì)量。目前公認人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。但是由于抗原本身的復(fù)雜性、病毒亞型較多等諸多問題,疫苗的研究也比較困難。因此,我們一直致力于尋找新的治療手段以延長患者生命,提高其生活質(zhì)量。乳酸桿菌為女性陰道的正常優(yōu)勢菌群,對維持陰道正常生態(tài)平衡起著關(guān)鍵作用,多項研究表明,宮頸癌的發(fā)生還與陰道微生態(tài)平衡失調(diào)有關(guān),其中,乳酸桿菌減少,導(dǎo)致陰道加德納菌或混合性厭氧菌大量繁殖,產(chǎn)生有害的物質(zhì),后者與其他的致癌因素(如人乳頭瘤病毒)聯(lián)合作用于宮頸,加速了宮頸癌的發(fā)生。目前研究表明上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)不僅是多細胞生物胚胎發(fā)育與器官形成的基礎(chǔ)過程,而且對腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移及多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展也發(fā)揮著重要作用。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)能促進細胞間的連接,維持其支架的穩(wěn)定,是EMT中最重要的中心因子之一,其表達下調(diào)往往是宮頸癌轉(zhuǎn)移的重要因素。本實驗旨在探索采用乳酸桿菌干預(yù),是否影響宮頸癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移,以及相應(yīng)的作用機制,以為宮頸癌的治療提供新的視角。方法:1體外實驗1.1培養(yǎng)乳酸桿菌(德氏乳桿菌DM8909)。1.2乳酸桿菌直接作用與人宮頸癌Hela細胞以及鼠宮頸癌細胞U14,(MOI:選取10:1,100:1,1000:1,分別作用24h,48h,72h,CCK-8細胞增殖試劑盒檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影響。1.3劃痕實驗檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞遷移的影響。1.4乳酸桿菌分別直接刺激Hela和U14,及通過transwell小室間接刺激宮頸癌細胞,與不同時間點收集細胞,提取蛋白,行Western blot檢測可能影響細胞生長、遷移的相應(yīng)因子E-鈣黏蛋白、波形蛋白(vimentin)、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表達情況。1.5 65 oC 30min滅活乳酸桿菌后作用于宮頸癌細胞,與不同時間點分別收集細胞行Western blot,檢測上述可能涉及到的因子的表達情況。2體內(nèi)實驗取4～6周齡的雌性BALB/C小鼠25只,隨機分為5組(荷瘤對照組,治療劑量組(2.25×106個/0.2ml)及相應(yīng)滅活菌組、高劑量組(5×106/0.2ml)及相應(yīng)滅活劑量組),每組5只。取對數(shù)生長期U14細胞2×106個/0.2ml接種于每組小鼠背部皮下。接種第二天后開始抑瘤實驗。治療劑量組及相應(yīng)滅活劑量組組分別在腫瘤周圍多點注射活或滅活的乳酸桿菌2.25×106/0.2ml(治療劑量),高劑量組及相應(yīng)滅活劑量組小鼠以同樣方式分別注射活或滅活的乳酸桿菌5×106/0.2ml(高劑量),每天一次,連續(xù)20天;荷瘤小鼠注射等量的PBS作為對照。每天檢測小鼠體重及腫瘤大小。停藥一天后,處死取瘤。稱體重并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(L)和短徑(W),并按腫瘤體積計算公式V=L·W2/2計算腫瘤體積。然后,切開腫瘤,觀察其內(nèi)部顏色、質(zhì)地、有無壞死區(qū)。將瘤組織分為兩部分,一部分10%多聚甲醛固定液固定后,切片行免疫組化,一部分提蛋白行Western Blot,檢測上述各因子表達。結(jié)果:1.乳酸桿菌對宮頸癌細胞的增殖無影響。2.乳酸桿菌作用于宮頸癌細胞后,24小時既表現(xiàn)出對宮頸癌細胞的遷移抑制作用。3.乳酸桿菌作用宮頸癌細胞后,上調(diào)了E-鈣黏蛋白的表達。在人宮頸癌Hela中,下調(diào)Snail的表達,但對小鼠宮頸癌細胞U14中的Snail表達無影響。但對vimentin、FOXO4、Twist及β-catenin的表達無影響。4.乳酸桿菌通過transwell間接刺激宮頸癌細胞Hela和U14后,可促進E-鈣黏蛋白的表達明顯增加。5.滅活乳酸桿菌作用于宮頸癌細胞后,E-鈣黏蛋白的表達與對照組無明顯差異。6.荷瘤小鼠體重在乳酸桿菌干預(yù)3天后開始具有統(tǒng)計學(xué)差異,治療劑量組體重均小于其他四組體重,并均具有統(tǒng)計學(xué)差異;高劑量組及相應(yīng)滅活劑量組的體重均小于荷瘤對照組和滅活治療劑量組的體重,并具有統(tǒng)計學(xué)差異;但荷瘤對照組和滅活治療劑量組之間,以及高劑量組及相應(yīng)滅活劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。7.治療劑量組及高劑量組腫瘤凈體積均小于其他三組體積及重量,并均具有統(tǒng)計學(xué)差異,但是治療劑量組和高劑量組之間,以及荷瘤實驗組、滅活劑量組和滅活高劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。8.治療劑量組及高劑量組的腫瘤中的E-鈣黏蛋白的表達明顯高于其他三組,但是治療劑量組和高劑量組組間以及荷瘤實驗組、滅活劑量組和滅活高劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。但是5組之間波形蛋白、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表達無統(tǒng)計學(xué)差異。9.免疫組化HE染色證實荷瘤小鼠模型為鱗癌。治療劑量組及高劑量組中E-鈣黏蛋白所占的比例要大于相應(yīng)滅活劑量組及對照PBS組并具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:1.乳酸桿菌對宮頸癌的增殖無明顯影響。2.乳酸桿菌對宮頸癌的遷移有抑制作用。2這種遷移作用是通過上調(diào)E-鈣黏蛋白表達實現(xiàn)。3在人宮頸癌中,可能是通過下調(diào)Snail而促進了E-cadherin的表達。4乳酸桿菌上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達并不受Twist、β-catenin影響。5乳酸桿菌上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達是通過其分泌到胞外的成分實現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖 1 CCK-8 檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影響。Fig.1 The proliferation of cervical cancer cells following stimulation wilactobacillus by CCK8 kit.Hela Ctrl0h

附 圖1 CCK-8 檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影proliferation of cervical cancer cells following stimlactobacillus by CCK8 kit.BHela Ctrl

21圖 4 蛋白印跡檢測乳酸桿菌及滅活乳酸桿菌刺激宮頸癌細胞后 E-cadh表達的影響。A 乳酸桿菌通過 transwell 小室間接刺激宮頸癌細胞后E-cadherin 表達的影響。B 滅活乳酸桿菌刺激宮頸癌細胞后 E-cadherin達的影響。C Hela 細胞 E-cadherin 灰度值分析。D U14 細胞 E-cadheri度值分析。Fig.4 Western blot analysis of E-cadherin expressions in cervical cancer cposted-coincubated with live or inactivated lactobacillus. A.The expressioE-cadherin in cervical cancer cells indirectly stimulated with lactobacilluthrough transwell. B The expression of E-cadherin in cervical cancer celindirectly stimulated with inactivated lactobacillus. C. Gray value analysisE-cadherin in Hela cells. D. Gray value analysis of E-cadherin in U14 cel

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2830938