目的:宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,是導致女性死亡的第二大癌癥。但是,目前主要采用放、化療治療中、晚期宮頸癌,無法降低患者的死亡率,且其無法避免的毒副作用大大降低了患者的生活質量。目前公認人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。但是由于抗原本身的復雜性、病毒亞型較多等諸多問題,疫苗的研究也比較困難。因此,我們一直致力于尋找新的治療手段以延長患者生命,提高其生活質量。乳酸桿菌為女性陰道的正常優(yōu)勢菌群,對維持陰道正常生態(tài)平衡起著關鍵作用,多項研究表明,宮頸癌的發(fā)生還與陰道微生態(tài)平衡失調有關,其中,乳酸桿菌減少,導致陰道加德納菌或混合性厭氧菌大量繁殖,產生有害的物質,后者與其他的致癌因素(如人乳頭瘤病毒)聯合作用于宮頸,加速了宮頸癌的發(fā)生。目前研究表明上皮/間質轉化(EMT)不僅是多細胞生物胚胎發(fā)育與器官形成的基礎過程,而且對腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移及多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展也發(fā)揮著重要作用。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)能促進細胞間的連接,維持其支架的穩(wěn)定,是EMT中最重要的中心因子之一,其表達下調往往是宮頸癌轉移的重要因素。本實驗旨在探索采用乳酸桿菌干預,是否影響宮頸癌細胞的生長、轉移,以及相應的作用機制,以為宮頸癌的治療提供新的視角。方法:1體外實驗1.1培養(yǎng)乳酸桿菌(德氏乳桿菌DM8909)。1.2乳酸桿菌直接作用與人宮頸癌Hela細胞以及鼠宮頸癌細胞U14,(MOI:選取10:1,100:1,1000:1,分別作用24h,48h,72h,CCK-8細胞增殖試劑盒檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影響。1.3劃痕實驗檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞遷移的影響。1.4乳酸桿菌分別直接刺激Hela和U14,及通過transwell小室間接刺激宮頸癌細胞,與不同時間點收集細胞,提取蛋白,行Western blot檢測可能影響細胞生長、遷移的相應因子E-鈣黏蛋白、波形蛋白(vimentin)、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表達情況。1.5 65 oC 30min滅活乳酸桿菌后作用于宮頸癌細胞,與不同時間點分別收集細胞行Western blot,檢測上述可能涉及到的因子的表達情況。2體內實驗取4～6周齡的雌性BALB/C小鼠25只,隨機分為5組(荷瘤對照組,治療劑量組(2.25×106個/0.2ml)及相應滅活菌組、高劑量組(5×106/0.2ml)及相應滅活劑量組),每組5只。取對數生長期U14細胞2×106個/0.2ml接種于每組小鼠背部皮下。接種第二天后開始抑瘤實驗。治療劑量組及相應滅活劑量組組分別在腫瘤周圍多點注射活或滅活的乳酸桿菌2.25×106/0.2ml(治療劑量),高劑量組及相應滅活劑量組小鼠以同樣方式分別注射活或滅活的乳酸桿菌5×106/0.2ml(高劑量),每天一次,連續(xù)20天;荷瘤小鼠注射等量的PBS作為對照。每天檢測小鼠體重及腫瘤大小。停藥一天后,處死取瘤。稱體重并用游標卡尺測量腫瘤長徑(L)和短徑(W),并按腫瘤體積計算公式V=L·W2/2計算腫瘤體積。然后,切開腫瘤,觀察其內部顏色、質地、有無壞死區(qū)。將瘤組織分為兩部分,一部分10%多聚甲醛固定液固定后,切片行免疫組化,一部分提蛋白行Western Blot,檢測上述各因子表達。結果:1.乳酸桿菌對宮頸癌細胞的增殖無影響。2.乳酸桿菌作用于宮頸癌細胞后,24小時既表現出對宮頸癌細胞的遷移抑制作用。3.乳酸桿菌作用宮頸癌細胞后,上調了E-鈣黏蛋白的表達。在人宮頸癌Hela中,下調Snail的表達,但對小鼠宮頸癌細胞U14中的Snail表達無影響。但對vimentin、FOXO4、Twist及β-catenin的表達無影響。4.乳酸桿菌通過transwell間接刺激宮頸癌細胞Hela和U14后,可促進E-鈣黏蛋白的表達明顯增加。5.滅活乳酸桿菌作用于宮頸癌細胞后,E-鈣黏蛋白的表達與對照組無明顯差異。6.荷瘤小鼠體重在乳酸桿菌干預3天后開始具有統(tǒng)計學差異,治療劑量組體重均小于其他四組體重,并均具有統(tǒng)計學差異;高劑量組及相應滅活劑量組的體重均小于荷瘤對照組和滅活治療劑量組的體重,并具有統(tǒng)計學差異;但荷瘤對照組和滅活治療劑量組之間,以及高劑量組及相應滅活劑量組之間無統(tǒng)計學差異。7.治療劑量組及高劑量組腫瘤凈體積均小于其他三組體積及重量,并均具有統(tǒng)計學差異,但是治療劑量組和高劑量組之間,以及荷瘤實驗組、滅活劑量組和滅活高劑量組之間無統(tǒng)計學差異。8.治療劑量組及高劑量組的腫瘤中的E-鈣黏蛋白的表達明顯高于其他三組,但是治療劑量組和高劑量組組間以及荷瘤實驗組、滅活劑量組和滅活高劑量組之間無統(tǒng)計學差異。但是5組之間波形蛋白、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表達無統(tǒng)計學差異。9.免疫組化HE染色證實荷瘤小鼠模型為鱗癌。治療劑量組及高劑量組中E-鈣黏蛋白所占的比例要大于相應滅活劑量組及對照PBS組并具有統(tǒng)計學差異。結論:1.乳酸桿菌對宮頸癌的增殖無明顯影響。2.乳酸桿菌對宮頸癌的遷移有抑制作用。2這種遷移作用是通過上調E-鈣黏蛋白表達實現。3在人宮頸癌中,可能是通過下調Snail而促進了E-cadherin的表達。4乳酸桿菌上調E-鈣黏蛋白的表達并不受Twist、β-catenin影響。5乳酸桿菌上調E-鈣黏蛋白的表達是通過其分泌到胞外的成分實現。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖 1 CCK-8 檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影響。Fig.1 The proliferation of cervical cancer cells following stimulation wilactobacillus by CCK8 kit.Hela Ctrl0h

附 圖1 CCK-8 檢測乳酸桿菌對宮頸癌細胞增殖的影proliferation of cervical cancer cells following stimlactobacillus by CCK8 kit.BHela Ctrl

21圖 4 蛋白印跡檢測乳酸桿菌及滅活乳酸桿菌刺激宮頸癌細胞后 E-cadh表達的影響。A 乳酸桿菌通過 transwell 小室間接刺激宮頸癌細胞后E-cadherin 表達的影響。B 滅活乳酸桿菌刺激宮頸癌細胞后 E-cadherin達的影響。C Hela 細胞 E-cadherin 灰度值分析。D U14 細胞 E-cadheri度值分析。Fig.4 Western blot analysis of E-cadherin expressions in cervical cancer cposted-coincubated with live or inactivated lactobacillus. A.The expressioE-cadherin in cervical cancer cells indirectly stimulated with lactobacilluthrough transwell. B The expression of E-cadherin in cervical cancer celindirectly stimulated with inactivated lactobacillus. C. Gray value analysisE-cadherin in Hela cells. D. Gray value analysis of E-cadherin in U14 cel

【參考文獻】

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本文編號：2830938