結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率分別占男性和女性全部惡性腫瘤的9.4%和10.1%,每年約有120萬名患者被診斷為結直腸癌,而有超過60萬名患者直接或間接死于結直腸癌。在西方發(fā)達國家,其發(fā)病率高居腫瘤第二位,死亡率高達33%。隨著我國經(jīng)濟水平和生活水平的持續(xù)提高,飲食習慣與結構的改變,國內(nèi)結直腸癌的發(fā)病率表現(xiàn)出明顯的增長趨勢,全國每年約有新發(fā)病例13萬,近幾年國內(nèi)結直腸癌發(fā)病率正以4%的速度遞增,已經(jīng)躍居我國惡性腫瘤死亡率第五位。東南沿海地帶成為結、直腸癌高發(fā)區(qū)域,發(fā)病率約為48/10萬,與西方發(fā)達國家類似,我國結直腸癌發(fā)病具有年輕化、家族聚集、遺傳易感等特征�，F(xiàn)階段結直腸癌的治療主要靠手術,但由于大部分腫瘤發(fā)現(xiàn)已經(jīng)是晚期,而且術后易發(fā)生復發(fā)、輔助治療療效不理想,都會影響病人的生存情況與治愈效果,因此,對結直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制需要進行進一步更深入的研究,以便探索更為有效的治療途徑。結直腸癌與其他類型腫瘤一樣,其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多水平、多基因參與的過程,伴隨著復雜的基因表達失調(diào),其中包括編碼及非編碼基因的結構和表達的異常。結直腸癌發(fā)生的分子機制尚未闡明,早干預、早發(fā)現(xiàn)和早治療是改善結直腸癌患者預后、提高患者治愈率的關鍵,深入研究結直腸癌相關基因的異常表達機制將有助于結直腸癌的預防、診斷、和治療。鋅指蛋白(ZNF)217基因定位在20q13.2,是一種鋅指蛋白,編碼為Kruppel樣的轉(zhuǎn)錄因子。ZNF217做為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,可以和CTBP1/2與組蛋白修飾酶結合相聯(lián)形成復合物,由其鋅指結構介導,然后和啟動子結合,對和細胞分化和器官形成有關的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制作用,ZNF217基因作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程,到目前為止,一些研究結果證實ZNF217在乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中表達上升,而且在乳腺癌和卵巢癌中已經(jīng)證實ZNF217與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關,在結直腸癌中,ZNF217表達水平增高,但與病人的病理特點、病人的預后之間的相關性,目前少有報道,同時闡明ZNF217通過什么途徑促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可為腫瘤的靶向治療提供新的位點,具有極其重要的意義,這進一步促使我們研究ZNF217在結直腸腫瘤環(huán)境中參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制。微小RNA(microRNA,miR JA)是一類內(nèi)生的,長度約16-24個核苷酸的小RNA分子,是當前處在研究熱點的非編碼RNA,它能夠與mRNA的種子序列配對結合,從而抑制其靶基因表達,是在位置和序列上都比較保守的一類基因。microRNA在細胞生長和發(fā)育過程中起多種作用,可以精密調(diào)節(jié)基因的蛋白合成,能夠與靶mRNAs 3'端非編碼區(qū)域(3'-UTR)相結合,使靶基因RNA降解或沉默從而阻止其迸一步的翻譯表達。目前,microRNA被認為是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的因子,microRNA能夠同時靶向多個基因,眾多的microRNA分子和它們所調(diào)控的靶基因在體內(nèi)形成復雜的網(wǎng)絡結構,參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和細胞惡性生物學行為改變�；蚪M的不穩(wěn)定是腫瘤細胞的一個重要特征,所以癌組織的基因表達和同一分化來源的正常組織的基因表達明顯不一樣,約50%的microRNA基因分布于染色質(zhì)斷裂位點和脆性位點,這些部位屬于基因組不穩(wěn)定部位,因此在不同類型腫瘤中發(fā)生的改變也有很大差異。有的miRNA起到癌基因的作用,促進細胞的增殖,促進腫瘤的惡化,促進癌細胞的遷移, 有的miRNA則起著抑癌基因的作用,能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和血管形成。microRNA-203(miR-203)是一個首先在皮膚細胞中鑒定出來的小分子,miR-203基因序列定位于人類染色體14q32上,該區(qū)域是不穩(wěn)定區(qū)域,含有52種miRNA的基因序列,編碼人類已知約12%的miRNA,成熟的miR-203由22個核苷酸組成,廣泛分布于人體各種組織器官,但具有組織分布差異性,是一種皮膚特異性miRNA。研究表明,miR-203啟動子甲基化或其他原因可引起大量靶基因如SNAI2、BMI-1、KLF4等表達異常,進而導致腫瘤的發(fā)生,miR-203已經(jīng)被證實在多種腫瘤組織中異常表達,如乳腺癌,膀胱癌,前列腺癌,胰腺癌,肝癌,血液系統(tǒng)腫瘤,食管癌,喉癌等,且在這些腫瘤組織中其含量與正常組織相比具有顯著地差異。miR-203的異常表達可以影響腫瘤的增殖、凋亡、血管浸潤,及淋巴結轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為,Yuan Y等在人食管鱗狀細胞癌中的研究表明miR-203可以通過調(diào)節(jié)△Np63介導的細胞通路起到抑制癌細胞增殖的作用。迄今為止,有關miR-203在結直腸癌中表達的研究報道較少,本研究旨在揭示結直腸癌中miR-203的表達情況,研究其對ZNF217基因的調(diào)控機制及對腫瘤細胞生物學行為的影響。第一部分ZNF217在結直腸癌中的表達及其與microRNA-203表達的相關性研究目的1.檢測并分析ZNF217在結直腸癌組織與相應正常癌旁組織中是否存在差異表達。2.分析ZNF217的表達與結直腸癌組織的臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、浸潤深度、局部淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、及臨床分期之間的關系。3.分析ZNF217在結直腸癌中的表達與患者預后之間的關系。4.檢測結直腸癌組織中miR-203的表達水平,并分析其與ZNF217的表達是否具有相關性。研究方法1.應用免疫組化方法檢測ZNF217在82例結直腸癌患者腫瘤組織及其相應癌旁正常組織中的表達,并分析腫瘤組織中ZNF217表達與結直腸癌患者臨床病理特點、與預后之間的關系。2.qRT-PCR方法檢測ZNF217mRNA水平和miR-203在結直腸癌組織中的表達,并用Pearson相關分析法分析腫瘤組織中ZNF217與miR-203表達的相關性。結果1.免疫組化結果顯示,ZNF217在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于相應的癌旁正常組織(PO.05)。2. ZNF217的表達水平與結直腸癌患者腫瘤大小(P=0.042)、浸潤深度(P=0.03)及局部淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.01)相關,而與年齡、性別、分化程度、遠處器官轉(zhuǎn)移與臨床分期無顯著相關性(P0.05)；ZNF217表達水平高的腫瘤患者5年總體生存率低于ZNF217表達水平低的患者(P=0.028)。3. Pearson相關分析結果表明,結直腸癌腫瘤組織中的ZNF217相對表達量miR-203的相對表達量顯著負相關(Pear son correlation=0.7431, P0.05)。結論1.ZNF217在結直腸癌癌腫瘤組織較相應癌旁組織表達增高,其表達水平與腫瘤組織的腫瘤大小、浸潤深度和局部淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關,ZNF217可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2.ZNF217的表達與miR-203的表達呈負相關,兩者可能共同參與了結直腸癌的發(fā)病過程�？傮w生存率低于ZNF217表達水平低的患者(P=0.028)。3. Pearson相關分析結果表明,結直腸癌腫瘤組織中的ZNF217相對表達量miR-203的相對表達量顯著負相關(Pear son correlation=0.7431, P0.05)。結論1.ZNF217在結直腸癌癌腫瘤組織較相應癌旁組織表達增高,其表達水平與腫瘤組織的腫瘤大小、浸潤深度和局部淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關,ZNF217可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2.ZNF217的表達與miR-203的表達呈負相關,兩者可能共同參與了結直腸癌的發(fā)病過程。第二部分ZNF217對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響研究目的研究ZNF217在結直腸癌細胞增殖,遷移、侵襲中的作用。研究方法1.通過脂質(zhì)體Lipofect2000將siRNA-ZNF217及對應的陰性對照序列轉(zhuǎn)染入結直腸癌細胞中,同時檢測轉(zhuǎn)染效率。2.采用MTT檢測轉(zhuǎn)染前后結直腸癌細胞增殖能力的變化；Transwell、室檢測轉(zhuǎn)染前后結直腸癌細胞遷移、侵襲能力的變化,探討ZNF217在結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用。結果與轉(zhuǎn)染siRNA-negative control的對照組細胞相比,siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染組的細胞ZNF217表達水平顯著降低,細胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱。結論ZNF217基因表達下降能夠抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。結果與轉(zhuǎn)染siRNA-negative control的對照組細胞相比,siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染組的細胞ZNF217表達水平顯著降低,細胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱。結論ZNF217基因表達下降能夠抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。第三部分miR-203調(diào)控結直腸癌ZNF217基因的研究研究目的1.生物信息學預測ZNF217的上游microRNA調(diào)節(jié)基因,并驗證二者的靶向關系。2.結直腸癌細胞系中轉(zhuǎn)染iR-203 mimics、miR-203 inhibitor,探討miR-203異常表達對結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的影響。3.探討ZNF217, miR-203聯(lián)合異常表達對結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的影響。研究方法1.利用脂質(zhì)體Lipofect2000分別將niR-203 mimics、miR-203 inhibitor和對應的陰性對照序列轉(zhuǎn)染入結直腸癌細胞中,同時檢測轉(zhuǎn)染效率。2.采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后結直腸癌細胞增殖能力的變化；Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染前后各組結直腸癌細胞增殖遷移和侵襲能力的變化。3.利用生物信息學分析軟件TargetScan和micrornaorg預測ZNF217的可能上游調(diào)節(jié)基因為miR-203；運用熒光素酶報告基因?qū)嶒?將含有ZNF217基因3'端非編碼區(qū)序列(WT-ZNF217 3'-UTR)或突變序列(MUT-ZNF217 3'-UTR)的熒光素酶報告載體分別與miR-203mimics 或miR-negative control共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞,檢測各組熒光素酶的活性,驗證預測結果；結直腸癌細胞系中轉(zhuǎn)染niR-203 mimics, miR-negative contro1,利用qRT-PCR和Westernblot方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后ZNF217mRNA和蛋白表達水平的變化。4.將miR-203 mimics或miR-negative control與ZNF217-siRNA共轉(zhuǎn)染到結直腸癌細胞系中,然后采用MTT、Transwell法遷檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖、遷移與侵襲能力的變化,探討ZNF217聯(lián)合miR-203影響結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制。結果1.miR-203表達增高能夠降低結直腸癌細胞增殖、遷移與侵襲能力,反之則引起結直腸癌細胞增殖、遷移與侵襲能力增強(P0.05)。2.生物信息學分析軟件預測結果顯示ZNF217的3'-UTR區(qū)含有可與miR-203互補結合的序列；熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,人胚腎293T細胞共轉(zhuǎn)染niR-203 mimics與含WT-ZNF2173'-UTR的熒光素酶報告載體時,細胞的熒光素酶活性明顯下降,顯著低于對照組(P0.05)；在轉(zhuǎn)染miR-203mimics的結直腸癌細胞中,ZNF217的RNA及蛋白水平均顯著下降(P0.05)。3.和對照組相比,轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217的結直腸癌細胞和轉(zhuǎn)染niR-203 mimics的結直腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力均減弱,而聯(lián)合轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217和miR-203 mimics與獨自轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217的結直腸癌細胞或獨自轉(zhuǎn)染miR-203 mimics細胞相比,結直腸癌細胞增殖、遷移與侵襲能力均顯著減弱,二者具有一定的協(xié)同作用。結論1.miR-203的表達水平降低能夠促進結直腸癌細胞的增殖、而miR-203的表達水平升高能夠抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。2.miR-203可以靶向調(diào)控ZNF217, ZNF217是miR-203在結直腸癌中的靶基因之一,表明miR-203/ZNF217在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用,miR-203可通過調(diào)控ZNF217的表達改變結直腸癌細胞的生物學行為,二者共同參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.34
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一部分 結直腸癌中組織中ZNF217表達和MicroRNA-203表達的相關性
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖表
    參考文獻
第二部分 ZNF217對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖表
    參考文獻
第三部分 miR-203調(diào)節(jié)結直腸癌ZNF217的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附圖表
    參考文獻
致謝
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1 夏偉;曹國軍;邵寧生;;MicroRNA靶基因的尋找及鑒定方法研究進展[J];中國科學(C輯:生命科學);2009年01期

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本文編號：2829488