發(fā)布時間：2020-09-28 13:51

　　 研究背景及目的:膽囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是膽道系統(tǒng)中一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤,在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中占于首位,在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占第五位。但隨著流行病學調查、研究的不斷深入,近年來發(fā)病率亦出現了逐年上升的趨勢。膽囊癌發(fā)病初期較隱匿,潛伏期長,早期診斷困難,往往發(fā)生在膽囊結石合并膽囊炎而行膽囊切除術時發(fā)現的“意外膽囊癌”,而無明顯的臨床表現。再加上手術方式尚不固定,很多意外膽囊癌行經腹腔鏡膽囊切除術而導致早期腹腔內廣泛轉移亦不為少數。而且,對不能手術者或術后復發(fā)或轉移者,藥物化學性治療以及放射治療,效果均不十分理想。因此,此種疾病越來越得到大家的重視,膽囊結石,膽囊炎至膽囊癌的“炎癌轉變”亦受到大家關注。對于膽囊癌發(fā)病的具體分子機制尚不特別明確,以及耐藥性強的特點,多種基因、信號轉導通路的研究都在廣泛的進行中,如Nakamura報道的EGFR、ERBB3和PTEN在膽囊癌中的發(fā)生了突變,以及針對HER2、VEGF、PI3k/PTEN、AKT/mTOR、FGFR、IDH、MEK/ERK和多激酶途徑的藥物或抑制劑的實驗的實施。但是,目前仍無關于膽囊癌的發(fā)生發(fā)展的具體分子機制及靶向治療的報道。同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一種十分重要的癌癥監(jiān)護基因,亦被認為是僅次于P53的第二大的腫瘤抑制性基因。PTEN編碼的蛋白質能夠抑制PI3K/Akt、MAPK、FRAP/mTOR、NF-κB等信號傳導通路,參與調節(jié)細胞生長、代謝、維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多種生命活動,其功能和表達的異常與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切相關性。PTEN可以通過干擾細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、阻礙腫瘤的侵襲和轉移、維持免疫穩(wěn)態(tài)等一系列進程,完成其強大的抑癌作用。在膽囊癌中,PTEN在其發(fā)生、發(fā)展等系列過程中也起著十分重要的作用。PTEN的缺失與膽囊癌,特別是膽囊腺癌的臨床、病理、預后之間的關系密切相關,但分子機制尚不明確。此文中,我們進一步探究PTEN在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及發(fā)揮功能的具體分子機制,為膽囊癌的臨床分子的靶向治療策略提供潛在的干預靶點和新的思路。研究方法:1.本研究獲取了2010年1月到2016年12月海軍軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治的膽囊癌患者,收集了經過根治性治療并經術后病理診斷為膽囊癌的患者的臨床病理資料。共350例患者納入了此項研究。所有患者均常規(guī)接受了術前的系列相關檢查,均予以行膽囊根治性切除性手術。臨床膽囊癌TNM(Tumor node metastasis,TNM)分期(2017)均根據AJCC(American Joint Committee on Cancer)(美國癌癥聯合委員會)(第八版)標準。該組患者均根據標準隨訪流程進行隨訪�？傮w生存時間是本次研究的終點。分類變量用例數(百分數)表示,組間比較應用χ2檢驗,Yates’校正檢驗或者Fisher’s精確檢驗。連續(xù)型變量用中位值(四分位數)進行表示,組間差異性比較,我們應用t檢驗或者Mann-Whitney U檢驗。采用Kaplan-Meier法,我們來估計,這組患者術后的總體生存率。采用Log-Rank檢驗的方法,比較生存分布之間差異。采用COX等比例風險回歸模型,我們探索了影響了膽囊癌患者的術后復發(fā)以及總體生存率的獨立的危險因素。利用SPSS 19.0和R軟件2.10.1(R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.r-project.org)進行數據分析。2.對本院收集的正常膽囊及膽囊癌組織提取的mRNA進行實時定量RT-PCR檢測,檢測PTEN在轉錄層面的表達水平。同時,抽取樣品蛋白進行蛋白質印跡分析。隨后對這些樣品進行石蠟包埋,后用免疫組織化學的方法檢測了PTEN蛋白的表達。3.對東方肝膽外科醫(yī)院張永杰教授手術組2014.1-2016.12行膽囊癌根治手術的患者的膽囊癌組織,共計157例蠟塊病理組織標本,進行免疫組織化學染色分析PTEN表達情況。用K-M方法,我們在檢測樣本中比較高、低表達PTEN的患者預后情況。4.對膽囊癌細胞系GBC-SD、EHGB1、NOZ、NZ細胞,提取蛋白,采用Western Blotting方法檢測PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平。設計針對PTEN基因的外顯子的引物對四種細胞系進行PCR檢測。并設計靶向PTEN探針,進行深度靶向測序分析。5.構建PTEN穩(wěn)定干擾的細胞系,進行PCR檢測,Western Blotting方法檢測在此細胞系中,PTEN的mRNA水平和蛋白水平。用此細胞系進行平板克隆形成實驗,同時CCK-8實驗法,來檢測細胞增殖的情況。6.對低表達PTEN和對照組細胞進行軟瓊脂克隆形成實驗來探討高低表達PTEN對膽囊癌細胞惡性生長的影響。隨后,用Matrigel-coated Boyden chamber檢測PTEN對膽囊癌細胞轉移和侵襲能力的影響。7.應用Western Blotting實驗檢測了的PARP、P53和γH2AX的蛋白水平,這些蛋白反應了DNA損傷程度。應用定量PCR和Western Blotting的方法檢測差異表達PTEN的癌細胞中是否存在EMT表型的轉變。8.選取多種通路的抑制劑和常用腫瘤化療藥物,用CCK-8試驗的方法對膽囊癌進行藥物篩選試驗。9.用穩(wěn)定干擾PTEN的NOZ、GBC-SD細胞系,使用吉西他濱(GEM)、5-Fu、EPB和Bortezomib分別處理干擾組和對照組,仍然使用CCK-8試驗。隨后對處理過的細胞進行Caspase3/7活性檢測。緊接著用光鏡觀察干擾PTEN的膽囊癌細胞死亡情況。對經過藥物處理的對照和干擾細胞進行PI染色,經熒光顯微鏡下計數檢測證實光鏡下所見。對Bortezomib和GEM處理發(fā)生凋亡細胞進行流式檢測。10.對體外培養(yǎng)NOZ對照和干擾PTEN的NOZ細胞系進行裸鼠皮下荷瘤試驗。11.PDX模型的建立。建模成功后,免疫組化CK19確認,同時進行PTEN蛋白染色,分為陽性和陰性/低表達組。再次將成功荷瘤組織體外擴增,并進行藥敏試驗。12.用腺病毒在GBC-SD細胞中過表達PTEN與干擾掉PTEN的細胞同時進行定量PCR檢測PTEN的表達與蛋白酶體的糜蛋白酶、胰蛋白酶和Caspase樣的活性之間的關系。應用Western Blotting方法分析了干擾PTEN和過表達PTEN細胞中PSMB1、PSMB5、PSMD10、PSMD11的蛋白水平。研究結果:1.本研究納入病人350例,單因素分析顯示,黃疸,腫瘤位于肝臟側,淋巴結N2、N1轉移,非根治性切除,腫瘤差分化,以及TNM分期IIIIV期為患者術后總生存的影響因素。多因素分析發(fā)現腫瘤位于肝臟側,淋巴結N2、N1轉移,非根治性切除以及TNM分期IIIIV期是患者術后總體生存的獨立危險因素。2.膽囊癌組織中PTEN在轉錄層面的表達低于正常膽囊組織。對收集的冰凍的膽囊癌和膽囊組織樣品進行分析,PTEN在6例腫瘤組織中5例呈低蛋白表達,4例膽囊癌組織中p-AKT呈現較高表達水平。對這兩組石蠟包埋后檢測PTEN,PTEN在正常膽囊組織中為高水平的表達,而在膽囊癌組織中約50%呈現低水平表達。3.在157例張永杰教授組實施手術時獲取的膽囊癌組織中,根據免疫組化PTEN蛋白表達強度分為2組,PTEN蛋白高有67例,PTEN蛋白低表達有90例。與高表達PTEN組患者相比,低表達PTEN組患者總的生存時間更短,預后更差(p=0.006)。且PTEN低表達是術后總體生存的獨立危險因素。4.四種膽囊癌細胞系檢測PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平,顯示GBC-SD細胞中PTEN為低水平表達,而另外三種相反,呈較高水平。提示PTEN的低表達促進了下游信號通路的活化。檢測了PTEN基因的9號外顯子拷貝數,GBC-SD細胞9號外顯子為單拷貝,其余3株細胞為雙拷貝。設計的靶向PTEN的探針,進行了深度靶向測序分析,GBC-SD細胞PTEN為雜合性丟失,其余細胞為雙拷貝,并且這四株細胞均沒有檢測到PTEN發(fā)生突變。5.建立穩(wěn)定干擾PTEN細胞系,行細胞克隆形成及CCK-8細胞增殖試驗,結果提示PTEN的干擾與否對正常培養(yǎng)的膽囊癌細胞增殖可能影響不大。采用軟瓊脂克隆形成實驗,干擾PTEN非常顯著的抑制了腫瘤細胞的惡性增殖,同時受抑制的還有膽囊癌細胞遷移及侵襲能力。6.測定DNA損傷的相關蛋白的水平,提示PTEN的干擾引起了基因組DNA的損傷,引發(fā)的基因組的不穩(wěn)定性。PTEN對膽囊癌間質樣表型有維持作用。7.相比野生型NOZ,PTEN單拷貝的GBC-SD膽囊癌細胞對多種藥物顯示較高的敏感性。8.干擾PTEN的表達增強了NOZ-shPTEN對GEM的藥物敏感性,EPB反而對藥物產生抵抗,對Bortezomib表現出高度藥物敏感性。Bortezomib處理使得更多PTEN敲低細胞發(fā)生凋亡。光鏡觀察和PI染色,處理后的細胞剪切的PARP及Caspase3水平,以及發(fā)生凋亡的細胞進行流式檢測也證實這一點。9.穩(wěn)定干擾PTEN的GBC-SD細胞系,干擾PTEN進一步增強了GBC-SD細胞對Bortezomib的藥物敏感性。Bortezomib處理使得更多PTEN敲低的GBC-SD細胞發(fā)生凋亡。10.體外培養(yǎng)的NOZ對照和干擾PTEN細胞系,進行裸鼠皮下荷瘤試驗以及藥敏試驗,shPTEN+BZ組腫瘤最小。shPTEN組的腫瘤組織內Bortezomib處理組Ki67蛋白水平顯著低于對照組和生理鹽水處理組染色,Bortezomib處理shPTEN組Caspase3上調最為顯著。11.PDX小鼠體內腫瘤按PTEN高低表達分組,分別給藥,結果證實單獨Bortezomib給藥對PTEN陰性PDX腫瘤細胞有好的治療效果。12.將過表達的和干擾過PTEN的GBC-SD細胞行RT-PCR,PTEN的表達顯著抑制了蛋白酶體的活性,干擾PTEN的細胞內蛋白酶體的活性則顯著上調。干擾PTEN顯著提高蛋白酶體各組分的蛋白水平,而過表達PTEN則可以顯著降低它們的蛋白水平。研究結論:根據以上實驗結果我們可以清楚地發(fā)現,PTEN在膽囊癌病人腫瘤組織中,存在較高比例的缺失或低表達,而在正常膽囊中則正常陽性表達。PTEN缺失或低表達的患者總生存時間短,惡性程度高。在膽囊癌細胞系中,我們發(fā)現,PTEN對腫瘤細胞的基因組穩(wěn)定性和DNA的損傷修復具有調節(jié)作用,而PTEN的缺失則會影響基因組的穩(wěn)定性和DNA的損傷,而導致較差的預后。我們選取了多種信號通路的抑制劑和臨床常用的腫瘤化療藥物進行針對膽囊癌治療的藥物篩選實驗。不管是PTEN缺失的腫瘤細胞,還是在裸鼠體內細胞荷瘤實驗,或是PDX小鼠體內行荷瘤實驗,均提示,在PTEN陰性組單獨BTZ給藥即可達到很好的治療效果。最后,我們進一步在細胞系中證實,PTEN的缺失或低表達上調了蛋白酶體組分的表達和蛋白酶活性,使得腫瘤細胞對高蛋白酶體活性產生高度依賴性。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

醫(yī)大學博士學位論文分化 294 (84.0%)分期 II 29 (8.3%) IV 321 (91.7%)二）總體預后分析研究截止隨訪日期是 2017 年 12 月，中位隨訪時間是 23.0 個月（四，8.4 - 30.5 個月）。隨訪期間 220 例患者發(fā)生了死亡。中位 OS 是 195%可信區(qū)間，12.6 - 22.0 個月），1 年的 OS 為 58.1 %，3 年 OS 為 34.7 OS 為 17.8 %（圖 2）。

PTEN 對膽囊癌的預后價值評估和化療敏感性的調節(jié)作用及機制的 mRNA，應用實時定量 RT-PCR 分析檢測了 PTEN 在轉錄層面的表達水平，結果顯示：在 17例膽囊癌中 PTEN 的 mRNA水平顯著低于正常膽囊組織（n=16）中 PTEN mRNA 表達水平 （p=0.047，圖 3A）。對收集冰凍的膽囊癌和膽囊組織樣品我們抽取蛋白進行了蛋白質印跡分析（Western Blotting），結果如圖 3B所示，與正常組織相比，PTEN 在 6 例腫瘤組織中 5 例呈低蛋白表達狀態(tài)，4例膽囊癌組織中 p-AKT 呈現較高表達水平，提示 PTEN 低表達可能影響了下游 PI3K-AKT 信號通路的活化。隨后，我們對收集的膽囊癌和正常膽囊標本進行了石蠟包埋處理，PTEN 的表達于切片后，我們行免疫組織化學方法檢測分析，結果如圖 3C 所示，PTEN 在正常膽囊組織中均有較高水平表達，在膽囊癌組織中，約 50%呈現低水平的表達。

圖 4.PTEN 在膽囊癌中免疫組織化學檢測和病人生存期分析。A:免疫組織化學染色分析 PTEN 在膽囊癌組織中表達；B：對 A 中 PTEN 免疫組織化學染色強度進行打分后分組；C: 用 Kaplan-Meier 方法來計算 PTEN 高低表達病人術后總生存期。表 4. PTEN 高低表達和臨床病理因素之間的關系變量 No (%)PTEN 表達P 值低表達 高表達年齡, 歲 0.857≤60 69 (43. 1) 39 30>60 88 (56.1) 51 37性別 0.973男性 56 (35.7) 32 24女性 101 (64.3) 58 43膽囊結石 0.995有 89 (56.7) 51 38無 68 (43.3) 39 29

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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本文編號：2828871