研究背景及目的:膽囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是膽道系統(tǒng)中一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤,在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中占于首位,在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占第五位。但隨著流行病學(xué)調(diào)查、研究的不斷深入,近年來發(fā)病率亦出現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)。膽囊癌發(fā)病初期較隱匿,潛伏期長(zhǎng),早期診斷困難,往往發(fā)生在膽囊結(jié)石合并膽囊炎而行膽囊切除術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的“意外膽囊癌”,而無明顯的臨床表現(xiàn)。再加上手術(shù)方式尚不固定,很多意外膽囊癌行經(jīng)腹腔鏡膽囊切除術(shù)而導(dǎo)致早期腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移亦不為少數(shù)。而且,對(duì)不能手術(shù)者或術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者,藥物化學(xué)性治療以及放射治療,效果均不十分理想。因此,此種疾病越來越得到大家的重視,膽囊結(jié)石,膽囊炎至膽囊癌的“炎癌轉(zhuǎn)變”亦受到大家關(guān)注。對(duì)于膽囊癌發(fā)病的具體分子機(jī)制尚不特別明確,以及耐藥性強(qiáng)的特點(diǎn),多種基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究都在廣泛的進(jìn)行中,如Nakamura報(bào)道的EGFR、ERBB3和PTEN在膽囊癌中的發(fā)生了突變,以及針對(duì)HER2、VEGF、PI3k/PTEN、AKT/mTOR、FGFR、IDH、MEK/ERK和多激酶途徑的藥物或抑制劑的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施。但是,目前仍無關(guān)于膽囊癌的發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制及靶向治療的報(bào)道。同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一種十分重要的癌癥監(jiān)護(hù)基因,亦被認(rèn)為是僅次于P53的第二大的腫瘤抑制性基因。PTEN編碼的蛋白質(zhì)能夠抑制PI3K/Akt、MAPK、FRAP/mTOR、NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)通路,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多種生命活動(dòng),其功能和表達(dá)的異常與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)性。PTEN可以通過干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、阻礙腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、維持免疫穩(wěn)態(tài)等一系列進(jìn)程,完成其強(qiáng)大的抑癌作用。在膽囊癌中,PTEN在其發(fā)生、發(fā)展等系列過程中也起著十分重要的作用。PTEN的缺失與膽囊癌,特別是膽囊腺癌的臨床、病理、預(yù)后之間的關(guān)系密切相關(guān),但分子機(jī)制尚不明確。此文中,我們進(jìn)一步探究PTEN在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及發(fā)揮功能的具體分子機(jī)制,為膽囊癌的臨床分子的靶向治療策略提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)和新的思路。研究方法:1.本研究獲取了2010年1月到2016年12月海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治的膽囊癌患者,收集了經(jīng)過根治性治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷為膽囊癌的患者的臨床病理資料。共350例患者納入了此項(xiàng)研究。所有患者均常規(guī)接受了術(shù)前的系列相關(guān)檢查,均予以行膽囊根治性切除性手術(shù)。臨床膽囊癌TNM(Tumor node metastasis,TNM)分期(2017)均根據(jù)AJCC(American Joint Committee on Cancer)(美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì))(第八版)標(biāo)準(zhǔn)。該組患者均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)隨訪流程進(jìn)行隨訪。總體生存時(shí)間是本次研究的終點(diǎn)。分類變量用例數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示,組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn),Yates’校正檢驗(yàn)或者Fisher’s精確檢驗(yàn)。連續(xù)型變量用中位值(四分位數(shù))進(jìn)行表示,組間差異性比較,我們應(yīng)用t檢驗(yàn)或者M(jìn)ann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法,我們來估計(jì),這組患者術(shù)后的總體生存率。采用Log-Rank檢驗(yàn)的方法,比較生存分布之間差異。采用COX等比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,我們探索了影響了膽囊癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)以及總體生存率的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。利用SPSS 19.0和R軟件2.10.1(R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.r-project.org)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2.對(duì)本院收集的正常膽囊及膽囊癌組織提取的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè),檢測(cè)PTEN在轉(zhuǎn)錄層面的表達(dá)水平。同時(shí),抽取樣品蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。隨后對(duì)這些樣品進(jìn)行石蠟包埋,后用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了PTEN蛋白的表達(dá)。3.對(duì)東方肝膽外科醫(yī)院張永杰教授手術(shù)組2014.1-2016.12行膽囊癌根治手術(shù)的患者的膽囊癌組織,共計(jì)157例蠟塊病理組織標(biāo)本,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析PTEN表達(dá)情況。用K-M方法,我們?cè)跈z測(cè)樣本中比較高、低表達(dá)PTEN的患者預(yù)后情況。4.對(duì)膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、EHGB1、NOZ、NZ細(xì)胞,提取蛋白,采用Western Blotting方法檢測(cè)PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平。設(shè)計(jì)針對(duì)PTEN基因的外顯子的引物對(duì)四種細(xì)胞系進(jìn)行PCR檢測(cè)。并設(shè)計(jì)靶向PTEN探針,進(jìn)行深度靶向測(cè)序分析。5.構(gòu)建PTEN穩(wěn)定干擾的細(xì)胞系,進(jìn)行PCR檢測(cè),Western Blotting方法檢測(cè)在此細(xì)胞系中,PTEN的mRNA水平和蛋白水平。用此細(xì)胞系進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn),同時(shí)CCK-8實(shí)驗(yàn)法,來檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況。6.對(duì)低表達(dá)PTEN和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)來探討高低表達(dá)PTEN對(duì)膽囊癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響。隨后,用Matrigel-coated Boyden chamber檢測(cè)PTEN對(duì)膽囊癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。7.應(yīng)用Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了的PARP、P53和γH2AX的蛋白水平,這些蛋白反應(yīng)了DNA損傷程度。應(yīng)用定量PCR和Western Blotting的方法檢測(cè)差異表達(dá)PTEN的癌細(xì)胞中是否存在EMT表型的轉(zhuǎn)變。8.選取多種通路的抑制劑和常用腫瘤化療藥物,用CCK-8試驗(yàn)的方法對(duì)膽囊癌進(jìn)行藥物篩選試驗(yàn)。9.用穩(wěn)定干擾PTEN的NOZ、GBC-SD細(xì)胞系,使用吉西他濱(GEM)、5-Fu、EPB和Bortezomib分別處理干擾組和對(duì)照組,仍然使用CCK-8試驗(yàn)。隨后對(duì)處理過的細(xì)胞進(jìn)行Caspase3/7活性檢測(cè)。緊接著用光鏡觀察干擾PTEN的膽囊癌細(xì)胞死亡情況。對(duì)經(jīng)過藥物處理的對(duì)照和干擾細(xì)胞進(jìn)行PI染色,經(jīng)熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)檢測(cè)證實(shí)光鏡下所見。對(duì)Bortezomib和GEM處理發(fā)生凋亡細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。10.對(duì)體外培養(yǎng)NOZ對(duì)照和干擾PTEN的NOZ細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤試驗(yàn)。11.PDX模型的建立。建模成功后,免疫組化CK19確認(rèn),同時(shí)進(jìn)行PTEN蛋白染色,分為陽性和陰性/低表達(dá)組。再次將成功荷瘤組織體外擴(kuò)增,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。12.用腺病毒在GBC-SD細(xì)胞中過表達(dá)PTEN與干擾掉PTEN的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)PTEN的表達(dá)與蛋白酶體的糜蛋白酶、胰蛋白酶和Caspase樣的活性之間的關(guān)系。應(yīng)用Western Blotting方法分析了干擾PTEN和過表達(dá)PTEN細(xì)胞中PSMB1、PSMB5、PSMD10、PSMD11的蛋白水平。研究結(jié)果:1.本研究納入病人350例,單因素分析顯示,黃疸,腫瘤位于肝臟側(cè),淋巴結(jié)N2、N1轉(zhuǎn)移,非根治性切除,腫瘤差分化,以及TNM分期IIIIV期為患者術(shù)后總生存的影響因素。多因素分析發(fā)現(xiàn)腫瘤位于肝臟側(cè),淋巴結(jié)N2、N1轉(zhuǎn)移,非根治性切除以及TNM分期IIIIV期是患者術(shù)后總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2.膽囊癌組織中PTEN在轉(zhuǎn)錄層面的表達(dá)低于正常膽囊組織。對(duì)收集的冰凍的膽囊癌和膽囊組織樣品進(jìn)行分析,PTEN在6例腫瘤組織中5例呈低蛋白表達(dá),4例膽囊癌組織中p-AKT呈現(xiàn)較高表達(dá)水平。對(duì)這兩組石蠟包埋后檢測(cè)PTEN,PTEN在正常膽囊組織中為高水平的表達(dá),而在膽囊癌組織中約50%呈現(xiàn)低水平表達(dá)。3.在157例張永杰教授組實(shí)施手術(shù)時(shí)獲取的膽囊癌組織中,根據(jù)免疫組化PTEN蛋白表達(dá)強(qiáng)度分為2組,PTEN蛋白高有67例,PTEN蛋白低表達(dá)有90例。與高表達(dá)PTEN組患者相比,低表達(dá)PTEN組患者總的生存時(shí)間更短,預(yù)后更差(p=0.006)。且PTEN低表達(dá)是術(shù)后總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。4.四種膽囊癌細(xì)胞系檢測(cè)PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平,顯示GBC-SD細(xì)胞中PTEN為低水平表達(dá),而另外三種相反,呈較高水平。提示PTEN的低表達(dá)促進(jìn)了下游信號(hào)通路的活化。檢測(cè)了PTEN基因的9號(hào)外顯子拷貝數(shù),GBC-SD細(xì)胞9號(hào)外顯子為單拷貝,其余3株細(xì)胞為雙拷貝。設(shè)計(jì)的靶向PTEN的探針,進(jìn)行了深度靶向測(cè)序分析,GBC-SD細(xì)胞PTEN為雜合性丟失,其余細(xì)胞為雙拷貝,并且這四株細(xì)胞均沒有檢測(cè)到PTEN發(fā)生突變。5.建立穩(wěn)定干擾PTEN細(xì)胞系,行細(xì)胞克隆形成及CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn),結(jié)果提示PTEN的干擾與否對(duì)正常培養(yǎng)的膽囊癌細(xì)胞增殖可能影響不大。采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),干擾PTEN非常顯著的抑制了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,同時(shí)受抑制的還有膽囊癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。6.測(cè)定DNA損傷的相關(guān)蛋白的水平,提示PTEN的干擾引起了基因組DNA的損傷,引發(fā)的基因組的不穩(wěn)定性。PTEN對(duì)膽囊癌間質(zhì)樣表型有維持作用。7.相比野生型NOZ,PTEN單拷貝的GBC-SD膽囊癌細(xì)胞對(duì)多種藥物顯示較高的敏感性。8.干擾PTEN的表達(dá)增強(qiáng)了NOZ-shPTEN對(duì)GEM的藥物敏感性,EPB反而對(duì)藥物產(chǎn)生抵抗,對(duì)Bortezomib表現(xiàn)出高度藥物敏感性。Bortezomib處理使得更多PTEN敲低細(xì)胞發(fā)生凋亡。光鏡觀察和PI染色,處理后的細(xì)胞剪切的PARP及Caspase3水平,以及發(fā)生凋亡的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)也證實(shí)這一點(diǎn)。9.穩(wěn)定干擾PTEN的GBC-SD細(xì)胞系,干擾PTEN進(jìn)一步增強(qiáng)了GBC-SD細(xì)胞對(duì)Bortezomib的藥物敏感性。Bortezomib處理使得更多PTEN敲低的GBC-SD細(xì)胞發(fā)生凋亡。10.體外培養(yǎng)的NOZ對(duì)照和干擾PTEN細(xì)胞系,進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn),shPTEN+BZ組腫瘤最小。shPTEN組的腫瘤組織內(nèi)Bortezomib處理組Ki67蛋白水平顯著低于對(duì)照組和生理鹽水處理組染色,Bortezomib處理shPTEN組Caspase3上調(diào)最為顯著。11.PDX小鼠體內(nèi)腫瘤按PTEN高低表達(dá)分組,分別給藥,結(jié)果證實(shí)單獨(dú)Bortezomib給藥對(duì)PTEN陰性PDX腫瘤細(xì)胞有好的治療效果。12.將過表達(dá)的和干擾過PTEN的GBC-SD細(xì)胞行RT-PCR,PTEN的表達(dá)顯著抑制了蛋白酶體的活性,干擾PTEN的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體的活性則顯著上調(diào)。干擾PTEN顯著提高蛋白酶體各組分的蛋白水平,而過表達(dá)PTEN則可以顯著降低它們的蛋白水平。研究結(jié)論:根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以清楚地發(fā)現(xiàn),PTEN在膽囊癌病人腫瘤組織中,存在較高比例的缺失或低表達(dá),而在正常膽囊中則正常陽性表達(dá)。PTEN缺失或低表達(dá)的患者總生存時(shí)間短,惡性程度高。在膽囊癌細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn),PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性和DNA的損傷修復(fù)具有調(diào)節(jié)作用,而PTEN的缺失則會(huì)影響基因組的穩(wěn)定性和DNA的損傷,而導(dǎo)致較差的預(yù)后。我們選取了多種信號(hào)通路的抑制劑和臨床常用的腫瘤化療藥物進(jìn)行針對(duì)膽囊癌治療的藥物篩選實(shí)驗(yàn)。不管是PTEN缺失的腫瘤細(xì)胞,還是在裸鼠體內(nèi)細(xì)胞荷瘤實(shí)驗(yàn),或是PDX小鼠體內(nèi)行荷瘤實(shí)驗(yàn),均提示,在PTEN陰性組單獨(dú)BTZ給藥即可達(dá)到很好的治療效果。最后,我們進(jìn)一步在細(xì)胞系中證實(shí),PTEN的缺失或低表達(dá)上調(diào)了蛋白酶體組分的表達(dá)和蛋白酶活性,使得腫瘤細(xì)胞對(duì)高蛋白酶體活性產(chǎn)生高度依賴性。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文分化 294 (84.0%)分期 II 29 (8.3%) IV 321 (91.7%)二）總體預(yù)后分析研究截止隨訪日期是 2017 年 12 月，中位隨訪時(shí)間是 23.0 個(gè)月（四，8.4 - 30.5 個(gè)月）。隨訪期間 220 例患者發(fā)生了死亡。中位 OS 是 195%可信區(qū)間，12.6 - 22.0 個(gè)月），1 年的 OS 為 58.1 %，3 年 OS 為 34.7 OS 為 17.8 %（圖 2）。

PTEN 對(duì)膽囊癌的預(yù)后價(jià)值評(píng)估和化療敏感性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的 mRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 分析檢測(cè)了 PTEN 在轉(zhuǎn)錄層面的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在 17例膽囊癌中 PTEN 的 mRNA水平顯著低于正常膽囊組織（n=16）中 PTEN mRNA 表達(dá)水平 （p=0.047，圖 3A）。對(duì)收集冰凍的膽囊癌和膽囊組織樣品我們抽取蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blotting），結(jié)果如圖 3B所示，與正常組織相比，PTEN 在 6 例腫瘤組織中 5 例呈低蛋白表達(dá)狀態(tài)，4例膽囊癌組織中 p-AKT 呈現(xiàn)較高表達(dá)水平，提示 PTEN 低表達(dá)可能影響了下游 PI3K-AKT 信號(hào)通路的活化。隨后，我們對(duì)收集的膽囊癌和正常膽囊標(biāo)本進(jìn)行了石蠟包埋處理，PTEN 的表達(dá)于切片后，我們行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)分析，結(jié)果如圖 3C 所示，PTEN 在正常膽囊組織中均有較高水平表達(dá)，在膽囊癌組織中，約 50%呈現(xiàn)低水平的表達(dá)。

圖 4.PTEN 在膽囊癌中免疫組織化學(xué)檢測(cè)和病人生存期分析。A:免疫組織化學(xué)染色分析 PTEN 在膽囊癌組織中表達(dá)；B：對(duì) A 中 PTEN 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度進(jìn)行打分后分組；C: 用 Kaplan-Meier 方法來計(jì)算 PTEN 高低表達(dá)病人術(shù)后總生存期。表 4. PTEN 高低表達(dá)和臨床病理因素之間的關(guān)系變量 No (%)PTEN 表達(dá)P 值低表達(dá) 高表達(dá)年齡, 歲 0.857≤60 69 (43. 1) 39 30>60 88 (56.1) 51 37性別 0.973男性 56 (35.7) 32 24女性 101 (64.3) 58 43膽囊結(jié)石 0.995有 89 (56.7) 51 38無 68 (43.3) 39 29

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2828871