第一部分HA介導CPPs修飾的載10-HCPT的相變脂質(zhì)納米粒的制備及其性能檢測目的制備一種新型多功能超聲分子探針----HA介導CPPs修飾的載10-HCPT的相變脂質(zhì)納米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs),檢測其粒徑、電位、形態(tài)、載藥量、包封率,探索其體外熱致相變、聲致相變的條件等。方法我們采用薄膜分散法、超聲乳化法和靜電吸附作用制備HA/CPPs-10-HCPT-NPs;通過Malvern激光粒度分析儀檢測其粒徑、電位;通過普通光鏡、激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡檢測其形態(tài)及其分散性;通過高效液相色譜儀檢測其載藥量和包封率;在體外加熱板加熱條件下探索其熱致相變條件;將HA/CPPs-10-HCPT-NPs加在瓊脂糖凝膠模型里,通過低強度聚焦超聲(LIFU)輻照探索其在體外聲致相變的條件。結(jié)果成功制備出納米粒HA/CPPs-10-HCPT-NPs,其懸液外觀呈乳白色,平均粒徑為(284.2±13.3)nm,平均電位為-(16.55±1.50)m V,普通光鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察呈點狀,分散性好,無成團聚集現(xiàn)象,透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其呈圓球形,包封率和載藥量分別是(48.10±3.13)%和(5.23±0.34)%,HA/CPPs-10-HCPT-NPs在體外發(fā)生熱致相變的溫度約為45℃,經(jīng)LIFU輻照,HA/CPPs-10-HCPT-NPs在體外發(fā)生聲致相變的條件為2.4 W/cm2 3min。結(jié)論成功制備了一種新型多功能超聲分子探針----HA介導CPPs修飾的載10-HCPT的相變脂質(zhì)納米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs),其大小較均一,形態(tài)較規(guī)則,分散性好,在一定體外條件下(加熱和超聲輻照)具有良好的液氣相變性能。第二部分HA介導CPPs修飾的載10-HCPT的相變脂質(zhì)納米粒聯(lián)合LIFU殺傷肝癌細胞的實驗研究目的評估HA/CPPs-10-HCPT-NPs與LIFU輻照聯(lián)合對肝癌細胞SMMC-7721的殺傷效果,為后續(xù)進一步開展體內(nèi)動物實驗奠定基礎。方法通過western blotting檢測SMMC-7721細胞膜CD44的表達情況;為觀察納米粒HA/CPPs-10-HCPT-NPs與SMMC-7721的靶向結(jié)合能力,我們將SMMC-7721細胞分為靶向組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs組),非靶向組(CPPs-10-HCPT-NPs組),干預組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs+HAase組),激光共聚焦顯微鏡觀察Di I標記的各種納米粒與SMMC-7721的靶向結(jié)合情況;為評估HA/CPPs-10-HCPT-NPs在體外的穿膜能力,我們通過培養(yǎng)3D多細胞腫瘤球(3D MCTS)模擬體內(nèi)實體瘤的腫瘤微環(huán)境,并將3D MCTS分為穿膜肽組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs組)和非穿膜肽組(HA/10-HCPT-NPs組),通過激光共聚焦顯微鏡分別觀察Di I標記的兩組納米粒穿透SMMC-7721的3D MCTS的能力;在抗增殖實驗中,將種植在96孔板里的SMMC-7721細胞分為如下12組:對照組,單純10-HCPT組,HA/CPPs-10-HCPT-NPs組,CPPs-10-HCPT-NPs組,HA/10-HCPT-NPs組,10-HCPT-NPs組,LIFU組,10-HCPT+LIFU組,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組,CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組,HA/10-HCPT-NPs+LIFU組,10-HCPT-NPs+LIFU組,通過CCK-8法檢測各組處理因素對肝癌細胞SMMC-7721存活的影響;在細胞凋亡實驗中,將SMMC-7721細胞按照抗增殖實驗的處理和分組,采用流式細胞術檢測各組處理因素對肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響。結(jié)果肝癌細胞SMMC-7721高表達CD44;在靶向組中,可見大量的HA/CPPs-10-HCPT-NPs與SMMC-7721細胞緊密結(jié)合,并有大量的納米粒進入細胞內(nèi),而在非靶向組,幾乎看不到CPPs-10-HCPT-NPs與細胞結(jié)合,在干預組,也幾乎看不到或僅可見少量納米粒與SMMC-7721結(jié)合;在3D MCTS模型中,在穿膜肽組可見大量的HA/CPPs-10-HCPT-NPs聚集在細胞球周圍,而在非穿膜肽組,則僅見少量的納米粒附著在細胞球體上,通過穿透深度檢測穿膜肽組納米粒的穿透深度為27.14μm,非穿膜肽組為9.83μm,前者是后者的2.76倍;通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)單純10-HCPT組較各納米粒組的細胞存活率低,靶向組較非靶向組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs組vs CPPs-10-HCPT-NPs組,HA/10-HCPT-NPs組vs 10-HCPT-NPs組)低,在所有分組肝癌細胞中,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組SMMC-7721細胞的存活率最低;最后通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)在所有分組中,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組SMMC-7721細胞的凋亡率最高。結(jié)論HA/CPPs-10-HCPT-NPs在HA的引導下能特異靶向結(jié)合到高表達CD44的SMMC-7721細胞上,并在CPPs的介導下能穿透進入更深的3D MCTS內(nèi),穿透細胞膜進入細胞內(nèi),靶向更多更深層次的肝癌細胞,從而實現(xiàn)HA/CPPs-10-HCPT-NPs精準高效靶向肝癌細胞的目的,在聯(lián)合LIFU輻照條件下,HA/CPPs-10-HCPT-NPs對肝癌SMMC-7721細胞有更顯著的殺傷作用。第三部分HA介導CPPs修飾的載10-HCPT的相變脂質(zhì)納米粒聯(lián)合LIFU診斷與治療肝癌的實驗研究目的評估HA/CPPs-10-HCPT-NPs聯(lián)合LIFU對裸鼠肝癌皮下移植瘤的診斷治療效果。方法為了解HA/CPPs-10-HCPT-NPs在裸鼠體內(nèi)靶向肝癌皮下移植瘤的能力,將荷瘤裸鼠分為靶向組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs組)和非靶向組(CPPs-10-HCPT-NPs組),將Di R標記的上述兩種納米粒分別經(jīng)裸鼠尾靜脈注入裸鼠體內(nèi),采用小動物活體熒光成像儀分別在注入后4h,24h采集活體熒光信號,并在24h后處死裸鼠,取下肝癌皮下移植瘤和心、肝、脾、肺、腎等主要器官進行熒光成像,分析兩組熒光強度的變化情況;為進一步證實HA/CPPs-10-HCPT-NPs在體內(nèi)的靶向性能,將Di I標記的HA/CPPs-10-HCPT-NPs和CPPs-10-HCPT-NPs納米粒分別注入荷瘤裸鼠體內(nèi),1h后處死裸鼠,取下肝癌皮下移植瘤進行快速冰凍切片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩組納米粒在腫瘤內(nèi)的分布情況;為了進一步驗證HA/CPPs-10-HCPT-NPs在體內(nèi)的靶向能力和增強超聲顯影的效果,將荷瘤裸鼠分為HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組,CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組,HA/CPPs-10-HCPT-NPs組,前兩組在相應納米粒注入體內(nèi)后1h開始LIFU輻照腫瘤部位,第三組不進行LIFU輻照,然后用超聲診斷儀探查LIFU輻照前后腫瘤部位的超聲聲像圖,并用DFY分析軟件對聲像圖感興趣區(qū)的回聲強度進行分析;為了評價HA/CPPs-10-HCPT-NPs聯(lián)合LIFU輻照對肝癌裸鼠皮下移植瘤治療效果,將荷瘤裸鼠分為12組,分別為對照組,10-HCPT純藥組,有肽有靶NPs組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs組),有肽無靶NPs組(CPPs-10-HCPT-NPs組),無肽有靶NPs組(HA/10-HCPT-NPs組),無肽無靶NPs組(10-HCPT-NPs組),LIFU組,10-HCPT+LIFU組,有肽有靶NPs+LIFU組(HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組),有肽無靶NPs+LIFU組(CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU組),無肽有靶NPs+LIFU組(HA/10-HCPT-NPs+LIFU組),無肽無靶NPs+LIFU組(10-HCPT-NPs+LIFU組)。對照組和單純LIFU輻照組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水,其余各組分別注入相同劑量10-HCPT的相應純藥和納米粒,注射1h后采用LIFU(3.2 W/cm2,占空比50%,5min,脈沖模式)對腫瘤部位進行輻照,從成瘤第20天開始至第30天,每兩天進行一次治療,第31天時處死各組裸鼠,分離出瘤子進行稱重,用游標卡尺測量最大長徑和最大寬徑,并計算抑瘤率和腫瘤體積,將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定后送HE、PCNA和TUNEL染色,計算各組腫瘤的增殖指數(shù)(PI)和凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果小動物活體熒光成像儀觀察發(fā)現(xiàn)HA/CPPs-10-HCPT-NPs組在4h和24h腫瘤部位均顯示明顯的熒光信號,而在CPPs-10-HCPT-NPs組,荷瘤裸鼠腫瘤部位未見明顯的熒光信號,24h處死裸鼠后離體腫瘤進行熒光成像,也可見HA/CPPs-10-HCPT-NPs組的腫瘤組織熒光信號強于CPPs-10-HCPT-NPs組,定量分析也驗證了前者的熒光強度也顯著高于后者,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.001);激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織快速冰凍切片發(fā)現(xiàn)在HA/CPPs-10-HCPT-NPs組的腫瘤組織內(nèi)散在分布點狀紅色熒光信號,而在CPPs-10-HCPT-NPs組的腫瘤組織切片里幾乎未見到納米粒的紅色熒光信號;在體內(nèi)聲致相變實驗中,我們發(fā)現(xiàn)LIFU輻照前的各組腫瘤部位的聲像圖均為低回聲,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組可見LIFU聚焦區(qū)域的腫瘤聲像圖呈現(xiàn)明顯的強回聲,而在CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組的腫瘤聲像圖未見明顯回聲增強信號,另外在無LIFU輻照的HA/CPPs-10-HCPT-NPs組同樣未發(fā)現(xiàn)回聲增強信號,用DFY分析軟件定量分析HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組在LIFU輻照前后的回聲強度增加顯著高于其余兩組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);在評估HA/CPPs-10-HCPT-NPs聯(lián)合LIFU輻照對肝癌裸鼠皮下移植瘤的治療效果實驗中,發(fā)現(xiàn)HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組的抑瘤率最高,體積最小,HE染色發(fā)現(xiàn)在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組的腫瘤壞死最明顯,PCNA染色發(fā)現(xiàn)在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組的腫瘤組織PI最低,TUNEL染色發(fā)現(xiàn)在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU輻照組的腫瘤組織的AI值最高。結(jié)論HA/CPPs-10-HCPT-NPs可特異靶向荷肝癌裸鼠皮下移植瘤,并穿過細胞外基質(zhì)和細胞膜屏障實現(xiàn)更深、更多腫瘤細胞的靶向,HA/CPPs-10-HCPT-NPs聯(lián)合LIFU輻照可明顯增強腫瘤部位的超聲顯像,并顯著抑制肝癌生長,因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs聯(lián)合LIFU輻照有望成為一種精準診療肝癌的新策略。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖 1.1 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 納 圖 1.2 DiI-HA/CPPs-10-HCPT-NPs納米粒乳液外觀 納米粒乳液外觀Figure 1.1 Picture of HA/CPPs-10-HCPT Figure1.2 Picture of DiI-HA/CPPs-10-HC-NPs emulsion -NPs emulsion圖 1.3 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 光鏡圖 圖 1.4 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 激光

圖 1.5 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 透射電鏡圖 圖 1.6 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 粒徑分布圖Figure 1.5 TEM photo of HA/CPPs-10- Figure 1.6 Diameter distribution of HA/CPPs-10-HCPT-NPs HCPT-NPs圖 1.7 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 電位分布圖Figure 1.7 Zeta potential distribution of HA/CPPs-10-HCPT-NPs

圖 1.5 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 透射電鏡圖 圖 1.6 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 粒徑分布圖Figure 1.5 TEM photo of HA/CPPs-10- Figure 1.6 Diameter distribution of HA/CPPs-10-HCPT-NPs HCPT-NPs圖 1.7 HA/CPPs-10-HCPT-NPs 電位分布圖Figure 1.7 Zeta potential distribution of HA/CPPs-10-HCPT-NPs

【參考文獻】

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本文編號：2826591