背景:乳腺癌發(fā)病率在全世界女性腫瘤患者中居首位,且發(fā)病率正在逐年遞增。這些乳腺癌患者中有75%為雌激素受體陽性患者。此類患者術(shù)后按療程接受內(nèi)分泌治療可以有效增加其無病生存期和總生存期。根據(jù)NCCN指南建議,絕經(jīng)前的激素受體陽性乳腺癌患者術(shù)后應(yīng)服用他莫昔芬5-10年。盡管他莫昔芬對絕經(jīng)前激素受體陽性乳腺癌患者療效顯著,仍有30%患者對他莫昔芬產(chǎn)生耐藥,表現(xiàn)為在治療期間或治療結(jié)束發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況。目前,對他莫昔芬耐藥的形成機制研究結(jié)論不一,主要的研究方向集中于:雌激素受體自身表達下調(diào)或其結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變;生長因子及其下游通路過度激活;雌激素受體與生長因子通路之間的交互作用;細(xì)胞自身能量代謝的改變;DNA損傷修復(fù)異常等。Nogo蛋白,是網(wǎng)狀蛋白家族中重要組成部分,包括Nogo-A,Nogo-B和NogoC三個亞型。其中,Nogo-B廣泛分布于外周組織。Ng BR是Nogo-B氨基端的特異性受體(Am Nogo-B),可分布于肝、腦、腎、乳腺等多種組織器官中,對血管增生、細(xì)胞凋亡等多種生物活動產(chǎn)生影響,并且可以影響肝癌細(xì)胞對細(xì)胞毒性藥物的敏感性。研究表明,Ng BR可以與Ras蛋白結(jié)合,使其活化,并穩(wěn)定在細(xì)胞膜上,促進下游酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號通路激活,促進腫瘤生長。Ng BR在激素受體陽性的乳腺癌中表達水平升高,且其表達水平與凋亡抑制基因survivin表達正相關(guān)。此外,Ng BR還可以通過促進乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化。乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也是他莫昔芬耐藥性形成的原因之一。然而,Ng BR對他莫昔芬耐藥性的形成的是否存在影響及作用機制尚不清楚。目的:本研究通過對比Ng BR在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D及其他莫昔芬耐性細(xì)胞中的表達變化,證明Ng BR對他莫昔芬耐藥性的影響,并通過Ng BR與EGFR和ERα相互作用探究他莫昔芬耐藥性形成的機制。方法:1、通過集落形成實驗及CCK-8細(xì)胞增殖實驗驗證MCF-7和T47D耐藥細(xì)胞的耐藥性,并對比耐藥細(xì)胞與非耐藥細(xì)胞關(guān)鍵因子的表達變化2、通過si RNA沉默Ng BR基因,并采用流式細(xì)胞術(shù)、集落形成等技術(shù)檢測耐藥細(xì)胞對他莫昔芬敏感性的改變。3、通過si RNA沉默抑癌基因p53,檢測Ng BR及survivin的變化以及沉默p53和survivin對他莫昔芬敏感性的影響。4、通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取Ng BR、p53相應(yīng)基因NUS1、TP53的RNA表達水平,并分析Ng BR與p53之間的關(guān)系。5、通過si RNA沉默Ng BR,用western blot技術(shù)檢測ERα和EGF及其下游信號通路磷酸化水平的變化。并通過免疫沉淀技術(shù)檢測Ras活性及Ng BR作用機制。6、對激素受體陽性的乳腺癌患者乳腺組織石蠟切片進行染色,檢測Ng BR、Nogo-B和survivin表達含量的關(guān)系。7、通過KMPLOT網(wǎng)站獲取激素受體陽性的乳腺癌患者生存信息,通過生存分析探究Ng BR對激素受體陽性的乳腺癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果:1、通過集落形成試驗和CCK-8證明,MCF-7-Tam R和T47D-Tam R對4-OHT敏感性降低。q PCR結(jié)果顯示MCF-7-Tam R中Ng BR的m RNA水平高。Western blot結(jié)果顯示與MCF-7和T47D相比,耐藥細(xì)胞中Ng BR和survivin水平升高,p53、ERα水平降低。2、通過流式細(xì)胞技術(shù)、臺盼藍染色和集落形成實驗證明,敲除Ng BR后MCF-7-Tam R和T47D-Tam R對4-OHT處理敏感性增加。3、通過western blot證明MCF-7-Tam R敲除Ng BR后,p53上調(diào),survivin下調(diào)。流式細(xì)胞試驗結(jié)果表明MCF-7細(xì)胞敲除p53后對4-OHT敏感性降低;敲除MCF-7-Tam R中survivin后,對4-OHT敏感性增加。T47D-Tam R也可得出相似結(jié)論。4、通過GEO數(shù)據(jù)檢索得到60例乳腺癌患者NUS1和TP53的m RNA表達水平,分析后得知二者表達關(guān)系為負(fù)相關(guān)。5、通過western blot證明敲除Ng BR會減弱EGFR及其下游信號通路AKT、ERK、MDM2以及ERα磷酸化,并影響EGF對survivin表達的促進作用。免疫沉淀室驗證明Ng BR通過激活Ras的活性,誘導(dǎo)EGF及其下游信號通路磷酸化。6、通過對22例乳腺癌患者石蠟切片進行免疫組化染色分析,得知survivin表達與Ng BR呈正相關(guān)。7、通過kmplot網(wǎng)站收集激素受體陽性(n=755)以及經(jīng)過內(nèi)分泌治療的激素受體陽性(n=335)乳腺癌患者信息,分析后得知Ng BR高表達的患者,其無復(fù)發(fā)生存時間較短。結(jié)論:1、Ng BR在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞中表達升高;2、Ng BR可通過survivin和p53影響他莫昔芬耐藥細(xì)胞的增殖、凋亡;3、Ng BR敲除可影響EGF及其下游信號通路和ERα磷酸化,并影響耐藥細(xì)胞生長;4、Ng BR高表達的患者預(yù)后較差。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

在生存率方面，城市及農(nóng)村5年生存率分別為77.85和55.9%，存在較大差異。圖1.1 世界范圍內(nèi)預(yù)計新發(fā)腫瘤及死亡率預(yù)測[1]（對比不同性別及經(jīng)濟發(fā)展水平）。

圖 1.2 乳腺癌內(nèi)分泌治療 NCCN 指南.2 他莫昔芬的耐藥機制他莫昔芬自從 1970 年發(fā)現(xiàn)至今，臨床上一直是治療雌激素受體陽性的絕乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療首選[31]，可以顯著降低該類患者的復(fù)發(fā)死亡率（如.3）。盡管他莫昔芬毒性較低，但也會發(fā)生一定的不良反應(yīng)，比如潮熱、陰道不增加、誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌等。

可以顯著降低該類患者的復(fù)發(fā)死亡率（如圖1.3）。盡管他莫昔芬毒性較低，但也會發(fā)生一定的不良反應(yīng)，比如潮熱、陰道分泌不增加、誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌等。圖 1.3 他莫昔芬治療 5 年可顯著降低 ER 陽性乳腺癌患者復(fù)發(fā)及死亡率[32]。1.2.1 他莫昔芬的功能及代謝途徑他莫昔芬是藥物代謝的前體，與其作用靶點雌激素受體 ER 結(jié)合較弱。在肝

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本文編號：2826620