研究背景:結(jié)直腸癌(colorectal cancer CRC)是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。全球范圍內(nèi),腸癌每年導(dǎo)致約600,000人死亡,約占癌癥死亡總數(shù)的8%。結(jié)直腸癌在男性癌癥患者中的發(fā)病率中高居第三位,而在女性癌癥患者中,發(fā)病率甚至高居第二位。以往的調(diào)查認(rèn)為結(jié)直腸癌主要高發(fā)于發(fā)達(dá)國家,發(fā)病年齡約在50-60歲;而近期的調(diào)查顯示,發(fā)展中國家腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢,而且發(fā)病年齡也呈現(xiàn)年輕化。CRC發(fā)病因素復(fù)雜,確切的致病因素仍然不明;目前認(rèn)為引起腸癌發(fā)生發(fā)展的原因主要包括環(huán)境和遺傳因素兩大類。15%-30%的CRC患者具有明確的家族遺傳病史,如家族腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性腸癌,均可通過引起染色體畸變而引起腸癌。而環(huán)境因素在腸癌的發(fā)病中的作用越來越得到重視,如人種地域的分布差異、營養(yǎng)物質(zhì)的過度攝入、肥胖、腸道菌群的失調(diào)、吸煙、飲酒等;不僅可以誘發(fā)腸癌,而且對腸癌的發(fā)展也可能起到了促進(jìn)作用。飲酒與疾病之間的發(fā)展關(guān)系復(fù)雜,雖然有研究表明,適量的飲酒對人體健康有益;但是越來越多的研究證實,飲酒與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。過去40年中,全球人均飲酒量上升了約一倍,而在亞洲地區(qū)上升的尤為明顯。統(tǒng)計學(xué)顯示約3.6%的癌癥發(fā)生與慢性飲酒有關(guān),酒精可以通過引起細(xì)胞色素酶的增高從而增強前致癌物如含酒精性的飲料、煙草、高脂飲食、化學(xué)致癌物質(zhì)等致癌作用;酒精通過乙醇脫氫酶的而產(chǎn)生的一級代謝產(chǎn)物是乙醛,乙醛可以通過引DNA的甲基化從而引起DNA的損傷。酒精可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生的活性含氧物質(zhì)可以引起脂質(zhì)體的過氧化,過氧化產(chǎn)物如4羥基壬烯酸可以引起DNA的突變;而近期研究表明,飲酒可以加速癌癥患者病程的進(jìn)展,其中就包括可以引起癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移引起癌癥患者死亡率增高的重要原因之一,統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,腸癌手術(shù)后五年生存率約在66%左右;而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移(包括臨近器官的浸潤轉(zhuǎn)移,血運系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移及器官的種植轉(zhuǎn)移),術(shù)后的五年生存率將僅僅只有20%。因此,明確酒精是否促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移,并調(diào)查其發(fā)病機制尤其重要。趨化因子,顧名思義,是一類對細(xì)胞有趨化作用的分子蛋白;共同特點包括:分子量小(約8-10千道爾頓)、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、其三級結(jié)構(gòu)由四個半胱氨酸殘基組成。自1987年第一個趨化因子CXCL8(IL-8)被發(fā)現(xiàn)以來,陸續(xù)有約50種趨化因子和20多種趨化因子受體被發(fā)現(xiàn)。多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞本身均可分泌趨化因子;而多種細(xì)胞表面均有趨化因子受體的表達(dá)。C-C趨化因子配體5(CCL5)是趨化因子的一種,可以由T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、滑膜成纖維細(xì)胞、管狀的上皮細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞自身分泌。CCL5在腫瘤生物學(xué)中的確切作用尚未完全闡明,CCL5可以引起適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng),從而抑制腫瘤的生成;但是同時又與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前研究表明,CCL5和其受體相互作用后,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值、遷徙、侵襲;直接的或者間接的招募T調(diào)節(jié)細(xì)胞,抑制CD8細(xì)胞的殺傷效應(yīng)形成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸;促進(jìn)腫瘤微血管的形成和骨轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(包括臨近器官浸潤轉(zhuǎn)移,血運和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,種植轉(zhuǎn)移)是腫瘤發(fā)展的重要特征之一;腫瘤的轉(zhuǎn)移需要腫瘤細(xì)胞遷移能力的增加,并且需要能量支持。腸腫瘤細(xì)胞多為上皮來源,腫瘤細(xì)胞一旦發(fā)生上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上向間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,遷移能力將增加,這已經(jīng)被廣泛報道。近年來越來越多的研究表明,細(xì)胞自噬和腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上高度保守生物學(xué)進(jìn)程;環(huán)境的變化或細(xì)胞內(nèi)能量不足時,通過自噬相關(guān)基因和復(fù)雜信號傳導(dǎo)通路調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)自我消化,提供維持細(xì)胞生存所需氨基酸和脂肪酸等能量支持。自噬與腫瘤之間存在相關(guān)性,許多研究表明自噬不僅具有腫瘤抑制的功能,也可以促進(jìn)腫瘤的存活。在正常組織中,自噬維持著組織的穩(wěn)態(tài);一旦自噬被抑制,組織正常的代謝被打破,將導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性、炎癥反應(yīng)、和非整倍性(在減數(shù)分裂的過程中同源染色體不分離而造成的一條或多條染色體的缺失或增加)得增加,這將增高腫瘤的發(fā)生率,對腫瘤早期形成起到促進(jìn)作用。但是如果自噬持續(xù)性缺失的話,腫瘤發(fā)生的進(jìn)程也將被阻斷。相反的是如果在腫瘤形成后期,腫瘤的生長需要大量的能量支持,此時如果自噬被激活,則可以通過對營養(yǎng)物質(zhì)的回收再利用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移,增加其對化療藥物的抵抗作用,對腫瘤細(xì)胞起到一定的保護作用。研究表明,正常乳腺組織中,氧含量和糖原含量分別為10KP和5n M;而乳腺癌組織中為4KP和0-2n M,可見腫瘤的生存環(huán)境十分惡劣;此時一旦自噬被激活,可以為腫瘤細(xì)胞提供額外的營養(yǎng)支持,從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展的進(jìn)程。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn),酒精可以刺激多種癌癥如肺癌、肝癌、腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為;有研究表明酒精可以引起多種細(xì)胞因子和趨化因子分泌增多。那么飲酒和腸癌疾病進(jìn)展之間是否存在相關(guān)性?在飲酒的腸癌患者病程中,趨化因子CCL5起到了哪些作用?是否通過引起腸癌細(xì)胞的自噬從而參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)?本課題將結(jié)合腸癌患者的飲酒病史,調(diào)查飲酒和腸癌進(jìn)展之間的關(guān)系。通過調(diào)查CCL5在飲酒和非飲酒腸癌患者臨床病理標(biāo)本的表達(dá),酒精體外刺激CRC細(xì)胞株,研究酒精和CCL5表達(dá)的關(guān)系。通過人為改變CCL5表達(dá)水平,體外實驗觀察對血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成,觀察CCL5對CRC細(xì)胞在增殖、周期、凋亡及轉(zhuǎn)移的變化情況的影響。通過生物信息學(xué)預(yù)測以及分子實驗,驗證CCL5是否可以引起自噬;自噬增高及阻斷自噬后,對CRC細(xì)胞遷移能力的影響;并進(jìn)一步調(diào)查其分子機制。探討CCL5在酒精促進(jìn)的腸癌進(jìn)展中的作用,為CRC的臨床治療提供新的線索。研究目的:本課題探討CCL5在飲酒的腸癌患者疾病進(jìn)程中的作用,并進(jìn)一步揭示其致病的分子機制。研究內(nèi)容:1.選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年全年手術(shù)治療的腸癌患者病例,通過統(tǒng)計分析,調(diào)查飲酒和腸癌進(jìn)展,患者術(shù)后五年生存率的關(guān)系。通過病理切片進(jìn)行免疫組化,檢測CCL5在飲酒患者和非飲酒患者病理組織中的表達(dá)情況。2.RT-PCR檢測HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細(xì)胞株酒精刺激前后,CCL5m RNA的表達(dá)情況。3.ELISA檢測酒精刺激前后,檢測HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細(xì)胞株CCL5分泌的變化。HT29和DLD-1細(xì)胞在酒精刺激后CCL5的分泌增多,因此選取HT29和DLD-1細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的研究。4.血管形成實驗觀察CCL5對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成能力的影響。5.酒精慢性刺激兩周以后,RT-PCR和Western bolt檢測HT29和DLD-1細(xì)胞中CCL5表達(dá)情況;ELISA檢測CCL5分泌情況。6.給予HT29和DLD-1細(xì)胞不同濃度CCL5慢性刺激兩周,隨后:(1)MTT法檢測HT29和DLD-1細(xì)胞株的細(xì)胞增殖,并繪制生長曲線圖。(2)流式細(xì)胞儀檢測HT29和DLD-1細(xì)胞株的細(xì)胞周期。(3)Annexin V/PI法檢測HT29和DLD-細(xì)胞株的凋亡。(4)平板克隆形成實驗觀察單個細(xì)胞的體外增殖能力。(5)軟瓊脂半固體集落形成法觀察細(xì)胞獨立性非錨定生長能力。(6)Transwell法觀察細(xì)胞的遷移能力。7.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細(xì)胞,透射電鏡(transmission electron microscope TEM)觀察自噬體形成的情況。通過Western bolt法,檢測LC3B和p62蛋白的變化,并結(jié)合CQ阻斷自噬,檢測自噬流的情況。同時結(jié)合免疫熒光實驗,證實自噬流的存在。8.抑制自噬后,觀察CCL5引起的細(xì)胞遷移能力的增加和細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。9.高通量測序(High-throughput sequencing)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),篩選出自噬通路中可能存在的分子通路,并通過Western blot技術(shù)進(jìn)行驗證;同時通過阻斷該通路,進(jìn)行反向驗證。10.阻斷該自噬信號通路,觀察CCL5引起的細(xì)胞遷移能力的增高和該自噬通路之間的關(guān)系。研究結(jié)果:1.通過對102CRC患者臨床病例分析及電話隨訪,發(fā)現(xiàn)飲酒和腫瘤的惡性程度分級,TNM分期,轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性(P0.05);飲酒的腸癌患者術(shù)后5年生存率更低(P0.01)。2.HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細(xì)胞株基礎(chǔ)水平均表達(dá)并分泌CCL5,酒精刺激腸癌細(xì)胞后,HT29和DLD-1細(xì)胞的CCL5分泌較基礎(chǔ)水平有明顯的增高(P0.05)。臨床病理切片顯示,飲酒患者癌和癌旁組織中的CCL5表達(dá)量較非飲酒患者有明顯增高(P0.05)。3.CCL5對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成能力沒有明顯的影響。4.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細(xì)胞兩周后,發(fā)現(xiàn)對腸癌細(xì)胞的增殖、周期、凋亡沒有明顯的影響;但是可以上調(diào)腸癌細(xì)胞的遷移能力(P0.01)。慢性酒精刺激引起HT29和DLD-1細(xì)胞遷移能力的增高,可以被CCL5Ab抵消;而敲除了酒精刺激引起的CCL5高表達(dá)的腸癌細(xì)胞,遷移能力也明顯降低。5.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細(xì)胞,通過TEM觀察,可以發(fā)現(xiàn)自噬體形成增多。通過Western blot、免疫熒光技術(shù),結(jié)合自噬阻斷劑,證明了自噬流的存在并且通暢。而阻斷了自噬,腸癌細(xì)胞的遷移能力隨之下降。6.高通量測序(High-throughput sequencing)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,提示CCL5通過AMPK信號通路中的AMPK Thr172發(fā)生磷酸化,從而引起自噬。阻斷AMPK的磷酸化,不僅可以阻斷自噬,同時對CCL5引起的細(xì)胞遷移能力的增加有一定程度的抵消作用。結(jié)論:1.飲酒促進(jìn)腸癌病程的進(jìn)展。2.CCL5在酒精引起HT29和DLD-1細(xì)胞遷移能力上調(diào)中起到了重要的作用。3.CCL5通過AMPK通路引起自噬,從而上調(diào)HT29和DLD-1細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

46圖 1 腸癌患者術(shù)后五年生存率和飲酒的關(guān)系。飲酒腸癌患者的術(shù)后五年生存率明顯降低。Figure 1 Survival rates of CRC patients and association of alcohol drinking. The post-op survivalrate within 5 years was shortened in CRC patients’ which with alcohol consumption.

47圖 2 酒精刺激前后，CCL5 在腸癌細(xì)胞株中，表達(dá)和分泌水平變化。a:腸癌細(xì)胞給予急性酒精刺激后，CCL5 及 CCR5 的變化；b:腸癌細(xì)胞給予急性酒精刺激后，CCL5 分泌的變化；c:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 細(xì)胞中 CCL5 的 mRNA 和蛋白水平均有上調(diào)；d:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 細(xì)胞分泌 CCL5 的水平較對照組有明顯增高。每組實驗獨立重復(fù)檢測三次，（*P<0.05 **P<0.01 #P>0.05 n=3）。Figure 2 Effect of EtOH on CCL5 expression and secretion in colorectal cancer cells.a-b: Colorectal cancer cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for indicated time. ThemRNA levels of CCL5 and CCR5 were analyzed by RT-PCR and GAPDH mRNA wasshown as a loading control. The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA（*P<0.05）. c-d: HT29 and DLD-1cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for 14days. The mRNA and protein levels of CCL5 were measured by RT-PCR and Western blot.The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA. Each data point was themean±SEM of three independent experiments and presented relative to the control values.（*P<0.05**P<0.01 #P>0.05 n=3）.

3.3 CCL5 對上皮細(xì)胞的血管形成率無明顯影響圖 3 飲酒和非飲酒腸癌患者病理標(biāo)本中 CCL5 的表達(dá) a:免疫組化顯示 CCL5 在飲酒，非飲酒的腸癌患者的癌和癌旁病理組織中的表達(dá)情況；b:統(tǒng)計學(xué)分析顯示飲酒患者癌和癌旁組織中的 CCL5 的表達(dá)均高于非飲酒患者（*P<0.05）。Figure 3 The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues whose with alcolhol consumptionor not. a: The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues was measured by IHC. b:The expression of CCL5was measured by MOD. *P<0.05

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Pablo Iribarren;;Chemokines and Chemokine Receptors:Their Manifold Roles in Homeostasis and Disease[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年02期

本文編號：2826276