背景:肝細胞性肝癌是發(fā)病率和死亡率高且預后極差的惡性腫瘤之一。目前臨床的治療方法包括外科手術切除、TACE術、放化療、免疫治療、基因治療等,但大多難以控制疾病的進展。化學藥物治療是目前使用最多的方法,但所應用的化療藥物對病人的毒副作用較大且療效不高。因此研發(fā)既有抗癌活性同時毒副作用低的新型抗腫瘤藥物一直是研究的重點。近些年從天然產物中提取有效抗腫瘤活性成分已成為一種新的研究趨勢�；覙浠ǘ嗵�(Grifola frondosa polysaccharide,GFP)是從藥食同源菌種灰樹花子實體及菌絲體中提取出的一種具有廣泛藥理作用的活性物質。已有研究報道過GFP對腫瘤細胞的增殖具有較顯著的抑制作用,且抗腫瘤效應的分子機制為誘導細胞凋亡。同時維生素C(Vitamin C,VC)也曾被報道過在體外實驗中具有誘導骨肉瘤細胞凋亡和誘導骨髓基質細胞自噬的作用。目的:本研究擬通過對灰樹花多糖抗腫瘤的文獻進行計量學分析,同時對多糖抑瘤效應中凋亡的作用進行Meta分析的研究方法,來了解灰樹花多糖抗腫瘤方面研究的現狀并探討多糖抗腫瘤主要的分子機制,并在此基礎上進行下一步的實驗研究。探討聯合應用灰樹花多糖和維生素C對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響,驗證二者在抗腫瘤效應上是否具有協(xié)同增效作用,此外闡明凋亡與自噬在聯合用藥治療肝癌細胞過程中發(fā)揮的作用,并進一步探討聯合用藥誘導肝癌細胞凋亡和自噬發(fā)生的具體分子機制,為有效指導臨床實踐用藥,開拓臨床治療肝癌新思路提供實驗基礎。方法:本研究首先對灰樹花提取物生物活性的相關研究文獻進行計量學分析,并應用可視化技術對灰樹花多糖抗腫瘤研究的現狀進行全面的了解。其次通過系統(tǒng)評價與Meta分析的方法對灰樹花多糖抑瘤作用的分子機制進行分析,探討灰樹花多糖抗腫瘤效應中誘導細胞凋亡的作用。隨后進行實驗研究,對于從灰樹花子實體中提取出來的多糖以及常規(guī)藥物維生素C,采用MTT法分別檢測單用藥和聯合用藥后對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響;應用等效線圖解法研究聯合用藥時二者之間的相互關系并尋求最佳聯合用藥濃度;流式細胞術檢測聯合用藥對細胞周期的影響;annexinv-fitc/pi雙染色法檢測對細胞凋亡的誘導作用;用倒置生物顯微鏡觀察藥物干預后smmc-7721細胞形態(tài)學的改變,并進一步用透射電鏡觀察細胞的超微結構變化;同時用hoechst33258凋亡熒光染色劑和mdc自噬熒光染色劑對細胞進行處理后,通過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡和自噬的發(fā)生情況;應用westernblotting(wb)法檢測凋亡相關蛋白bax、bcl-2、parp及自噬相關蛋白beclin-1、lc3、akt和phospho-akt蛋白的表達情況;通過比較全細胞蛋白和胞質蛋白中細胞色素c的表達量來判斷此過程中是否有細胞色素c的釋放;另外分別檢測藥物處理后細胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性變化情況。從分子生物學水平檢測細胞凋亡與自噬水平的改變,并探討此過程中細胞遵循何種信號轉導通路發(fā)生凋亡和自噬。結果:文獻分析結果顯示,在對灰樹花提取物生物活性的諸多研究中,灰樹花多糖的抗腫瘤效應一直是研究的重點與熱點,而系統(tǒng)評價和meta分析結果表明誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡是其發(fā)揮抑瘤效應的主要機制。實驗結果顯示,灰樹花多糖和維生素c均可抑制肝癌smmc-7721細胞增殖,且呈時間-劑量依賴性。等效線圖解法分析結果表明小劑量的gfp(0.6mg/ml)與vc聯合應用時,二者具有協(xié)同增效抗腫瘤作用,根據mtt結果最終選定聯合用藥濃度為0.2mg/mlgfp聯合0.3mmvc,此時聯合用藥對smmc-7721細胞抑制率為68.81%±1.12,高于單用gfp(16.03%±1.80)和vc(29.85%±1.02)。流式細胞術檢測結果顯示聯合用藥后細胞發(fā)生g2/m期阻滯,且細胞凋亡率從對照組的3.22%±0.23上升至聯合用藥組的64.45%±1.41,而聯合用藥組的細胞凋亡率分別是gfp組的6.88倍和vc組的2.24倍。藥物處理肝癌細胞24小時后,光學顯微鏡與透射電鏡下均可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生改變,出現染色質邊集、胞質疏松等早期凋亡現象,同時在胞質中可觀察到有雙層膜結構的自噬泡出現。hoechst33258染色后,gfp、vc及聯合用藥處理的細胞中均可觀察到典型的細胞核偏向一側的凋亡細胞核變化情況。mdc染色后vc與聯合用藥干預后可在細胞胞質中見到熒光加強的自噬顆粒,且凋亡與自噬現象均是聯合用藥組更加明顯。wb結果顯示聯合藥物干預后,與對照組相比,促凋亡蛋白bax表達上調、抗凋亡蛋白bcl-2表達下降、caspase-3底物parp表達增強。同時對照組、gfp、vc與聯合用藥組四個組全細胞蛋白中的細胞色素c表達無差別,而除對照組外其余三個組細胞的胞質蛋白中細胞色素c表達增強,說明藥物干預后細胞色素c釋放到胞質中。此外,聯合用藥后細胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增強。提示聯合用藥后肝癌細胞smmc-7721凋亡水平上升,且主要遵循內源性線粒體途徑發(fā)生凋亡。wb結果同時顯示,聯合用藥后細胞自噬相關蛋白beclin-1表達增強、自噬分子標志物LC3-II表達上調,LC3-II/LC3-I比例上升,說明細胞自噬活性增強,但在接下來的WB實驗中,細胞總Akt和phospho-Akt蛋白表達均增強,說明經典負性調控的自噬信號轉導途徑PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號轉導通路可能不參與此過程。結論:文獻計量學分析結果表明,灰樹花多糖的抗腫瘤作用一直是其生物活性研究的重點。Meta分析結果也顯示,多糖抑瘤效應主要的分子機制為誘導腫瘤細胞凋亡。進一步的實驗結果提示,小劑量的GFP聯合VC對肝癌細胞SMMC-7721具有顯著的抗腫瘤活性,且二者具有協(xié)同增效作用。藥物干預后細胞的凋亡和自噬均被激活,藥物一方面通過內源性線粒體途徑誘導細胞凋亡,另一方面誘導細胞發(fā)生自噬,從而發(fā)揮抑制腫瘤的效應。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

16五、技術路線圖1-1 “灰樹花多糖聯合維生素C誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡與自噬的研究”技術路線Figure1-1 Technical route of “Study of Grifola frondosa polysaccharide and vitamin Cinduced apoptosis and autophagy in hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells”

關鍵詞則其對應的結點相對越大，同樣合作發(fā)文越多的作者對應的節(jié)點也越大。2.3 技術路線圖2-1 技術路線Figure 2-1 Technical route

CBM 數據庫檢索到193篇中文文獻，Web of Science 數據庫檢索到513篇文獻，PubMed 檢索到320篇文獻，去除重復文獻后余下706篇文獻且全為英文文獻。每年發(fā)文數量隨時間變化趨勢如圖2-2和圖2-3，對于灰樹花的研究國內從1989年開始，但研究數量較少，在1990至1993年以及1997年的研究數量甚至為0。自1998年開始，研究逐漸增多，在2007年達到頂峰（23篇，占全部文獻的11.92%），隨后研究數量有所下降。而在Web of Science和PubMed 數據庫檢索到的英文文獻中，對灰樹花的研究始于1984年，自2001年開始逐年增加

本文編號：2823941