背景:肝細(xì)胞性肝癌是發(fā)病率和死亡率高且預(yù)后極差的惡性腫瘤之一。目前臨床的治療方法包括外科手術(shù)切除、TACE術(shù)、放化療、免疫治療、基因治療等,但大多難以控制疾病的進(jìn)展�；瘜W(xué)藥物治療是目前使用最多的方法,但所應(yīng)用的化療藥物對(duì)病人的毒副作用較大且療效不高。因此研發(fā)既有抗癌活性同時(shí)毒副作用低的新型抗腫瘤藥物一直是研究的重點(diǎn)。近些年從天然產(chǎn)物中提取有效抗腫瘤活性成分已成為一種新的研究趨勢(shì)。灰樹花多糖(Grifola frondosa polysaccharide,GFP)是從藥食同源菌種灰樹花子實(shí)體及菌絲體中提取出的一種具有廣泛藥理作用的活性物質(zhì)。已有研究報(bào)道過GFP對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有較顯著的抑制作用,且抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)維生素C(Vitamin C,VC)也曾被報(bào)道過在體外實(shí)驗(yàn)中具有誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞自噬的作用。目的:本研究擬通過對(duì)灰樹花多糖抗腫瘤的文獻(xiàn)進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析,同時(shí)對(duì)多糖抑瘤效應(yīng)中凋亡的作用進(jìn)行Meta分析的研究方法,來了解灰樹花多糖抗腫瘤方面研究的現(xiàn)狀并探討多糖抗腫瘤主要的分子機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。探討聯(lián)合應(yīng)用灰樹花多糖和維生素C對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響,驗(yàn)證二者在抗腫瘤效應(yīng)上是否具有協(xié)同增效作用,此外闡明凋亡與自噬在聯(lián)合用藥治療肝癌細(xì)胞過程中發(fā)揮的作用,并進(jìn)一步探討聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)生的具體分子機(jī)制,為有效指導(dǎo)臨床實(shí)踐用藥,開拓臨床治療肝癌新思路提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:本研究首先對(duì)灰樹花提取物生物活性的相關(guān)研究文獻(xiàn)進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析,并應(yīng)用可視化技術(shù)對(duì)灰樹花多糖抗腫瘤研究的現(xiàn)狀進(jìn)行全面的了解。其次通過系統(tǒng)評(píng)價(jià)與Meta分析的方法對(duì)灰樹花多糖抑瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行分析,探討灰樹花多糖抗腫瘤效應(yīng)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,對(duì)于從灰樹花子實(shí)體中提取出來的多糖以及常規(guī)藥物維生素C,采用MTT法分別檢測(cè)單用藥和聯(lián)合用藥后對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響;應(yīng)用等效線圖解法研究聯(lián)合用藥時(shí)二者之間的相互關(guān)系并尋求最佳聯(lián)合用藥濃度;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期的影響;annexinv-fitc/pi雙染色法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用;用倒置生物顯微鏡觀察藥物干預(yù)后smmc-7721細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,并進(jìn)一步用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化;同時(shí)用hoechst33258凋亡熒光染色劑和mdc自噬熒光染色劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生情況;應(yīng)用westernblotting(wb)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、parp及自噬相關(guān)蛋白beclin-1、lc3、akt和phospho-akt蛋白的表達(dá)情況;通過比較全細(xì)胞蛋白和胞質(zhì)蛋白中細(xì)胞色素c的表達(dá)量來判斷此過程中是否有細(xì)胞色素c的釋放;另外分別檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性變化情況。從分子生物學(xué)水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡與自噬水平的改變,并探討此過程中細(xì)胞遵循何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生凋亡和自噬。結(jié)果:文獻(xiàn)分析結(jié)果顯示,在對(duì)灰樹花提取物生物活性的諸多研究中,灰樹花多糖的抗腫瘤效應(yīng)一直是研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn),而系統(tǒng)評(píng)價(jià)和meta分析結(jié)果表明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是其發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的主要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,灰樹花多糖和維生素c均可抑制肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間-劑量依賴性。等效線圖解法分析結(jié)果表明小劑量的gfp(0.6mg/ml)與vc聯(lián)合應(yīng)用時(shí),二者具有協(xié)同增效抗腫瘤作用,根據(jù)mtt結(jié)果最終選定聯(lián)合用藥濃度為0.2mg/mlgfp聯(lián)合0.3mmvc,此時(shí)聯(lián)合用藥對(duì)smmc-7721細(xì)胞抑制率為68.81%±1.12,高于單用gfp(16.03%±1.80)和vc(29.85%±1.02)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥后細(xì)胞發(fā)生g2/m期阻滯,且細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的3.22%±0.23上升至聯(lián)合用藥組的64.45%±1.41,而聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率分別是gfp組的6.88倍和vc組的2.24倍。藥物處理肝癌細(xì)胞24小時(shí)后,光學(xué)顯微鏡與透射電鏡下均可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、胞質(zhì)疏松等早期凋亡現(xiàn)象,同時(shí)在胞質(zhì)中可觀察到有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡出現(xiàn)。hoechst33258染色后,gfp、vc及聯(lián)合用藥處理的細(xì)胞中均可觀察到典型的細(xì)胞核偏向一側(cè)的凋亡細(xì)胞核變化情況。mdc染色后vc與聯(lián)合用藥干預(yù)后可在細(xì)胞胞質(zhì)中見到熒光加強(qiáng)的自噬顆粒,且凋亡與自噬現(xiàn)象均是聯(lián)合用藥組更加明顯。wb結(jié)果顯示聯(lián)合藥物干預(yù)后,與對(duì)照組相比,促凋亡蛋白bax表達(dá)上調(diào)、抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)下降、caspase-3底物parp表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)對(duì)照組、gfp、vc與聯(lián)合用藥組四個(gè)組全細(xì)胞蛋白中的細(xì)胞色素c表達(dá)無差別,而除對(duì)照組外其余三個(gè)組細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白中細(xì)胞色素c表達(dá)增強(qiáng),說明藥物干預(yù)后細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中。此外,聯(lián)合用藥后細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增強(qiáng)。提示聯(lián)合用藥后肝癌細(xì)胞smmc-7721凋亡水平上升,且主要遵循內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)生凋亡。wb結(jié)果同時(shí)顯示,聯(lián)合用藥后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)增強(qiáng)、自噬分子標(biāo)志物L(fēng)C3-II表達(dá)上調(diào),LC3-II/LC3-I比例上升,說明細(xì)胞自噬活性增強(qiáng),但在接下來的WB實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞總Akt和phospho-Akt蛋白表達(dá)均增強(qiáng),說明經(jīng)典負(fù)性調(diào)控的自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能不參與此過程。結(jié)論:文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果表明,灰樹花多糖的抗腫瘤作用一直是其生物活性研究的重點(diǎn)。Meta分析結(jié)果也顯示,多糖抑瘤效應(yīng)主要的分子機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,小劑量的GFP聯(lián)合VC對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721具有顯著的抗腫瘤活性,且二者具有協(xié)同增效作用。藥物干預(yù)后細(xì)胞的凋亡和自噬均被激活,藥物一方面通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,另一方面誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,從而發(fā)揮抑制腫瘤的效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

16五、技術(shù)路線圖1-1 “灰樹花多糖聯(lián)合維生素C誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡與自噬的研究”技術(shù)路線Figure1-1 Technical route of “Study of Grifola frondosa polysaccharide and vitamin Cinduced apoptosis and autophagy in hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells”

關(guān)鍵詞則其對(duì)應(yīng)的結(jié)點(diǎn)相對(duì)越大，同樣合作發(fā)文越多的作者對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)也越大。2.3 技術(shù)路線圖2-1 技術(shù)路線Figure 2-1 Technical route

CBM 數(shù)據(jù)庫檢索到193篇中文文獻(xiàn)，Web of Science 數(shù)據(jù)庫檢索到513篇文獻(xiàn)，PubMed 檢索到320篇文獻(xiàn)，去除重復(fù)文獻(xiàn)后余下706篇文獻(xiàn)且全為英文文獻(xiàn)。每年發(fā)文數(shù)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)如圖2-2和圖2-3，對(duì)于灰樹花的研究國(guó)內(nèi)從1989年開始，但研究數(shù)量較少，在1990至1993年以及1997年的研究數(shù)量甚至為0。自1998年開始，研究逐漸增多，在2007年達(dá)到頂峰（23篇，占全部文獻(xiàn)的11.92%），隨后研究數(shù)量有所下降。而在Web of Science和PubMed 數(shù)據(jù)庫檢索到的英文文獻(xiàn)中，對(duì)灰樹花的研究始于1984年，自2001年開始逐年增加

本文編號(hào)：2823941