肺癌是全世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因,80%-85%是非小細胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC),在我國非小細胞肺癌發(fā)病率也是逐年增加,其中以肺腺癌最多見。目前,肺腺癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療以及生物治療等,其中化療是治療中晚期肺腺癌患者的重要手段之一。但在臨床治療過程中許多中晚期患者療效差,面對晚期肺腺癌患者臨床上只有“含鉑類藥物化療”這唯一支持治療的方法,雖然它在一定程度上增加了患者的總生存期(Overall survival,OS),但它的上限也僅限于20%的反應(yīng)率或/和8-10月的中位生存期,主要原因就是腫瘤細胞增殖過快、侵襲性強和/或出現(xiàn)化療藥物耐藥。究其原因就是關(guān)鍵的驅(qū)動基因例如:EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、BRAF,MET的突變,其中KRAS基因會持續(xù)的刺激細胞生長,并阻止細胞死亡,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,伴有KRAS基因突變的肺腺癌患者會有更高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機率。所以KRAS基因是目前確認的腫瘤靶向治療藥物的重要基因標記之一,目前臨床上給予KRAS基因無突變的患者西妥昔單抗和貝伐珠單抗有關(guān)靶向治療藥物,能獲得明顯的治療效果,而KRAS基因突變的患者還未有好的靶向藥物治療。DEAD 盒多肽 43(DEAD(Asp-—Glu-Ala—Asp)box polypeptide 43,DDX43]是最初在人橫紋肌肉瘤LB23-SAR細胞株中鑒定的一種腫瘤特異性基因,DDX43基因位于染色體6q12-13,由648個氨基酸組成,全長2 300bp,主要定位于細胞質(zhì)。研究揭示,DDX43基因通過調(diào)節(jié)KRAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲、腫瘤免疫及腫瘤耐藥等方面起重要作用,并且高表達于多種類型腫瘤中。司美替尼是一種小分子MEK1/MEK2抑制劑(分裂原活化抑制劑),在臨床上逐漸被用于治療非小細胞肺癌,司美替尼下調(diào)KRAS、臨床證據(jù)表明在KRAS突變的肺非小細胞癌還不存在靶向治療,而臨床上患者采用司美替尼聯(lián)合多烯紫杉醇能產(chǎn)生增效作用。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因表達調(diào)控方式,它可由內(nèi)源產(chǎn)生或有由人為的轉(zhuǎn)染進入沉默RNA(silencing RNA),它可以特異的剔除或關(guān)閉基因的表達,因此在醫(yī)學(xué)上用途廣泛。目前已知siRNA是以帶有專一性的方式來調(diào)節(jié)基因的表達,從而參與RNA干擾現(xiàn)象。此外,siRNA利用多種不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)可以導(dǎo)入靶細胞內(nèi),從而達到對指定的目標基因產(chǎn)生獨有的敲弱效果。因此可利用這種技術(shù)來對已知序列的基因進行標定和沉默,這種技術(shù)的運用使siRNA成為研究基因功能或/和目標藥物的一種重要的技術(shù)方法和手段。本實驗研究擬通過研究DDX43在肺腺癌組織、細胞中的表達以及沉默DDX43肺腺癌細胞中DDX43的表達情況,體內(nèi)外觀察DDX43基因沉默后司美替尼對肺腺癌化療敏感性的影響,為臨床上對于KRAS突變的肺腺癌患者尋找靶向藥物以及增強司美替尼化療敏感性奠定理論上基礎(chǔ)。本研究共分以下四個部分。第一部分DDX43在肺腺癌組織中的表達及其意義方法1.分別針對正常肺組織(62例)、肺泡上皮不典型增生組織(31例)及肺腺癌組織標本(62例)利用免疫組織化學(xué)SP法、蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)、RT-PCR、熒光原位雜交技術(shù)檢測DDX43蛋白水平及mRNA水平表達情況。2.統(tǒng)計學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用軟件SPSS19.0進行處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗、計量資料行t檢驗或方差分析,及Spearman進行相關(guān)性分析,檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.免疫組化SP法:DDX43蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒;熒光原位雜交:DDX43 mRNA陽性表達單標呈綠色信號;兩者均定位于肺腺癌細胞的胞質(zhì)內(nèi);在正常肺組織及肺泡不典型增生組織內(nèi)蛋白和mRNA表達水平呈現(xiàn)陰性表達低表達。2.在正常肺組織、肺泡不典型增生和肺腺癌組織中,通過免疫組化、Western blot聯(lián)合檢測顯示:DDX43蛋白水平陽性表達率依次升高,三者間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在正常肺組織、肺泡不典型增生和肺腺癌組織中,通過RT-PCR、熒光原位雜交聯(lián)合檢測顯示:DDX43mRNA表達水平亦依次升高,三者間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.不同肺腺癌病理亞型中,DDX43蛋白、mRNA的表達無明顯差別(P0.05)。4.DDX43蛋白、mRNA的表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的肺腺癌組織中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.DDX43蛋白、mRNA的表達在有胸膜侵犯組的肺腺癌組織中顯著高于無胸膜侵犯組,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6 DDX43蛋白、mRNA的表達在有脈管侵犯組的肺腺癌組織中顯著高于無脈管侵犯組,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.DDX43蛋白、mRNA的表達均與肺腺癌患者的年齡、性別無關(guān)(P0.05)。第二部分DDX43 siRNA表達載體的構(gòu)建方法1.構(gòu)建重組載體 pSilencer3.1-DDX43siRNA。2.設(shè)立1個陰性對照siRNA載體和已構(gòu)建好的3個DDX43siRNA載體均分別轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞A549細胞株,并獲得穩(wěn)定的細胞株。3.應(yīng)用Western blot方法檢測A549細胞中DDX43蛋白的相對表達量;采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測A549細胞中DDX43 mRNA的相對表達量,從而選出抑制效果最好DDX43siRNA。4.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用軟件SPSS19.0進行處理,計數(shù)資料采用χ2檢驗、計量資料行t檢驗或方差分析。檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.成功構(gòu)建了pSilencer3.1-DDX43siRNA1、pSilencer3.1-DDX43siRNA2及 pSilencer 3.1-DDX43siRNA3 重組載體。2.DDX43siRNAl、DDX43siRNA2 和 DDX43siRNA3 重組載體分別轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞后,DDX43蛋白和mRNA的表達水平均顯著低于未處理的A549細胞組和siRNA對照組(P0.05)。3.三個DDX43siRNA載體,組間兩兩相比,DDX43mRNA表達在DDX43siRNAl 和 DDX43siRNA3 之間無差異(P0.05);DDX43siRNA2 組中DDX43 mRNA的表達水平顯著低于DDX43siRNAl和DDX43siRNA3(P0.05)。第三部分DDX43siRNA干擾表達載體體外對司美替尼抑制肺腺癌A549細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的影響方法1分組培養(yǎng)肺腺癌A549細胞株,A組:正常對照組,A549細胞株未經(jīng)過任何處理;B組:DDX43siRNA2+司美替尼組,載體DDX43siRNA2轉(zhuǎn)染24h肺腺癌A549細胞后,接著用10μmol/L司美替尼處理A549細胞12h;C組:司美替尼組,10μmol/L Selumetinib培養(yǎng)A549持續(xù) 12h。2.使用免疫印跡蛋白(Westernblot)、免疫細胞化學(xué)檢測各實驗組細胞中的DDX43蛋白表達情況;采用原位雜交、RT-PCR方法檢測各實驗組細胞中的DDX43mRNA 的表達。3.運用流式細胞儀、MTT和TUNEL方法檢測各實驗組A549細胞凋亡和增殖情況。4.統(tǒng)計學(xué)處理:在具體的處理程序內(nèi)使用SPSS19.0軟件,使用χ2檢驗、方差分析或者是t檢驗,實際的檢驗水準被確定為α = 0.05。結(jié)果1.免疫細胞化學(xué)及Western blot檢測結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,肺腺癌A549細胞中DDX43蛋白表達不斷的下降,兩方面的要素對比,其中的區(qū)別存在對應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)價值(P0.05)。2.原位雜交及RT-PCR檢測結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,肺腺癌A549細胞中DDX43mRNA表達明顯上調(diào),組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.MTT法檢測結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)比較,A549細胞生長抑制率明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.流式細胞技術(shù)及TUNEL檢測A549細胞凋亡的結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,凋亡細胞數(shù)顯著逐漸增加,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第四部分DDX43siRNA干擾表達載體體內(nèi)對司美替尼誘導(dǎo)的肺腺癌移植瘤細胞生物學(xué)行為的影響方法1.構(gòu)建肺腺癌裸鼠移植瘤模型。2.分組飼養(yǎng)帶瘤裸鼠,A組:正常對照組,瘤體內(nèi)注射無菌生理鹽水;B組:DDX43 siRNA2+司美替尼組,瘤體內(nèi)注射DDX43 siRNA2及司美替尼(濃度:5mg/Kg);C組:司美替尼組,瘤體內(nèi)注射司美替尼(濃度5mg/Kg)。各實驗組:3day/注射一次,共注射6次。3.觀察和記錄各實驗組裸鼠移植瘤的生長狀況,并繪制生長曲線。4.采用免疫組化、Western blot方法檢測各實驗組移植瘤組織中DDX43蛋白表達情況;5.運用熒光原位雜交、RT-PCR方法檢測各實驗組移植瘤組織中DDX43 mRNA的表達情況。6.采用TUNEL法檢測各實驗組腫瘤細胞的凋亡情況。7.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件處理,計數(shù)資料采用χ2檢驗、計量資料行t檢驗或方差分析,檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)的移植瘤體積顯著大于B組(DDX43siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.免疫組化和Western blot檢測蛋白的結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)的裸鼠移植瘤組織中DDX43蛋白表達明顯高于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.熒光原位雜交及RT-PCR檢測mRNA結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)的裸鼠移植瘤組織中DDX43 mRNA表達明顯高于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.TUNEL法檢測凋亡的結(jié)果:A組(正常對照組)和C組(司美替尼組)細胞中凋亡指數(shù)(AI)顯著低于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。全文結(jié)論1.DDX43在肺腺癌組織中高表達。2.肺腺癌發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移均與DDX43蛋白和mRNA表達有關(guān)。3.構(gòu)建好的載體中,成功篩選具有最好抑制效果的載體是DDX43siRNA2。4.人肺腺癌癌A549細胞轉(zhuǎn)染DDX43 siRNA干擾表達載體后,細胞中DDX43蛋白和mRNA的表達均下調(diào)。5.沉默DDX43后聯(lián)合司美替尼可體外促進肺腺癌A549細胞凋亡,增強司美替尼抑制肺腺癌A549細胞增殖。6.沉默DDX43后聯(lián)合司美替尼可體內(nèi)促進移植瘤細胞凋亡,增強司美替尼對肺腺癌裸鼠移植瘤生長抑制。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

邐第一部分ＤＤＸ４３在肺腺癌組織中的表達及其意義邐逡逑表１．３正常肺組織組織、肺泡上皮高級別上皮內(nèi)瘤變及肺腺癌組織中ＤＤＸ４３蛋白表達逡逑Ｔａｂｌｅ邋１．３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＤＸ４３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ａｌｖｅｏｌａｒ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ，ａｌｖｅｏｌａｒ邋ａｔｙｐｉｃａｌ逡逑ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ邋ａｎｄ邋ＮＳＣＬＣ逡逑＾邐例數(shù)——Ｔ逡逑邐：邐＋邋陽性率（％）邐逡逑正常肺組織邐６２邐６２邐０邐０逡逑肺腺癌邐６２邐７邐５５邐８８．７邐６３．１５邐０．００逡逑肺泡上皮不典型增生邐３１邐１９邐１２邐３８Ｊ邐逡逑？邐＞＇邋’邐１邋？？邐？《邐：＇．／邋１邐－？．心？？邋＾邐ｉ邐？＇邋＾逡逑

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本文編號：2823881