肺癌是全世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因,80%-85%是非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC),在我國(guó)非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率也是逐年增加,其中以肺腺癌最多見。目前,肺腺癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療以及生物治療等,其中化療是治療中晚期肺腺癌患者的重要手段之一。但在臨床治療過程中許多中晚期患者療效差,面對(duì)晚期肺腺癌患者臨床上只有“含鉑類藥物化療”這唯一支持治療的方法,雖然它在一定程度上增加了患者的總生存期(Overall survival,OS),但它的上限也僅限于20%的反應(yīng)率或/和8-10月的中位生存期,主要原因就是腫瘤細(xì)胞增殖過快、侵襲性強(qiáng)和/或出現(xiàn)化療藥物耐藥。究其原因就是關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)基因例如:EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、BRAF,MET的突變,其中KRAS基因會(huì)持續(xù)的刺激細(xì)胞生長(zhǎng),并阻止細(xì)胞死亡,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,伴有KRAS基因突變的肺腺癌患者會(huì)有更高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)率。所以KRAS基因是目前確認(rèn)的腫瘤靶向治療藥物的重要基因標(biāo)記之一,目前臨床上給予KRAS基因無突變的患者西妥昔單抗和貝伐珠單抗有關(guān)靶向治療藥物,能獲得明顯的治療效果,而KRAS基因突變的患者還未有好的靶向藥物治療。DEAD 盒多肽 43(DEAD(Asp-—Glu-Ala—Asp)box polypeptide 43,DDX43]是最初在人橫紋肌肉瘤LB23-SAR細(xì)胞株中鑒定的一種腫瘤特異性基因,DDX43基因位于染色體6q12-13,由648個(gè)氨基酸組成,全長(zhǎng)2 300bp,主要定位于細(xì)胞質(zhì)。研究揭示,DDX43基因通過調(diào)節(jié)KRAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲、腫瘤免疫及腫瘤耐藥等方面起重要作用,并且高表達(dá)于多種類型腫瘤中。司美替尼是一種小分子MEK1/MEK2抑制劑(分裂原活化抑制劑),在臨床上逐漸被用于治療非小細(xì)胞肺癌,司美替尼下調(diào)KRAS、臨床證據(jù)表明在KRAS突變的肺非小細(xì)胞癌還不存在靶向治療,而臨床上患者采用司美替尼聯(lián)合多烯紫杉醇能產(chǎn)生增效作用。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因表達(dá)調(diào)控方式,它可由內(nèi)源產(chǎn)生或有由人為的轉(zhuǎn)染進(jìn)入沉默RNA(silencing RNA),它可以特異的剔除或關(guān)閉基因的表達(dá),因此在醫(yī)學(xué)上用途廣泛。目前已知siRNA是以帶有專一性的方式來調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而參與RNA干擾現(xiàn)象。此外,siRNA利用多種不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)可以導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi),從而達(dá)到對(duì)指定的目標(biāo)基因產(chǎn)生獨(dú)有的敲弱效果。因此可利用這種技術(shù)來對(duì)已知序列的基因進(jìn)行標(biāo)定和沉默,這種技術(shù)的運(yùn)用使siRNA成為研究基因功能或/和目標(biāo)藥物的一種重要的技術(shù)方法和手段。本實(shí)驗(yàn)研究擬通過研究DDX43在肺腺癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)以及沉默DDX43肺腺癌細(xì)胞中DDX43的表達(dá)情況,體內(nèi)外觀察DDX43基因沉默后司美替尼對(duì)肺腺癌化療敏感性的影響,為臨床上對(duì)于KRAS突變的肺腺癌患者尋找靶向藥物以及增強(qiáng)司美替尼化療敏感性奠定理論上基礎(chǔ)。本研究共分以下四個(gè)部分。第一部分DDX43在肺腺癌組織中的表達(dá)及其意義方法1.分別針對(duì)正常肺組織(62例)、肺泡上皮不典型增生組織(31例)及肺腺癌組織標(biāo)本(62例)利用免疫組織化學(xué)SP法、蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)、RT-PCR、熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)DDX43蛋白水平及mRNA水平表達(dá)情況。2.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用軟件SPSS19.0進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、計(jì)量資料行t檢驗(yàn)或方差分析,及Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.免疫組化SP法:DDX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒;熒光原位雜交:DDX43 mRNA陽(yáng)性表達(dá)單標(biāo)呈綠色信號(hào);兩者均定位于肺腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi);在正常肺組織及肺泡不典型增生組織內(nèi)蛋白和mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)陰性表達(dá)低表達(dá)。2.在正常肺組織、肺泡不典型增生和肺腺癌組織中,通過免疫組化、Western blot聯(lián)合檢測(cè)顯示:DDX43蛋白水平陽(yáng)性表達(dá)率依次升高,三者間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在正常肺組織、肺泡不典型增生和肺腺癌組織中,通過RT-PCR、熒光原位雜交聯(lián)合檢測(cè)顯示:DDX43mRNA表達(dá)水平亦依次升高,三者間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.不同肺腺癌病理亞型中,DDX43蛋白、mRNA的表達(dá)無明顯差別(P0.05)。4.DDX43蛋白、mRNA的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的肺腺癌組織中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.DDX43蛋白、mRNA的表達(dá)在有胸膜侵犯組的肺腺癌組織中顯著高于無胸膜侵犯組,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 DDX43蛋白、mRNA的表達(dá)在有脈管侵犯組的肺腺癌組織中顯著高于無脈管侵犯組,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.DDX43蛋白、mRNA的表達(dá)均與肺腺癌患者的年齡、性別無關(guān)(P0.05)。第二部分DDX43 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法1.構(gòu)建重組載體 pSilencer3.1-DDX43siRNA。2.設(shè)立1個(gè)陰性對(duì)照siRNA載體和已構(gòu)建好的3個(gè)DDX43siRNA載體均分別轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株,并獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株。3.應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)A549細(xì)胞中DDX43蛋白的相對(duì)表達(dá)量;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞中DDX43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,從而選出抑制效果最好DDX43siRNA。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用軟件SPSS19.0進(jìn)行處理,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、計(jì)量資料行t檢驗(yàn)或方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.成功構(gòu)建了pSilencer3.1-DDX43siRNA1、pSilencer3.1-DDX43siRNA2及 pSilencer 3.1-DDX43siRNA3 重組載體。2.DDX43siRNAl、DDX43siRNA2 和 DDX43siRNA3 重組載體分別轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞后,DDX43蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著低于未處理的A549細(xì)胞組和siRNA對(duì)照組(P0.05)。3.三個(gè)DDX43siRNA載體,組間兩兩相比,DDX43mRNA表達(dá)在DDX43siRNAl 和 DDX43siRNA3 之間無差異(P0.05);DDX43siRNA2 組中DDX43 mRNA的表達(dá)水平顯著低于DDX43siRNAl和DDX43siRNA3(P0.05)。第三部分DDX43siRNA干擾表達(dá)載體體外對(duì)司美替尼抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的影響方法1分組培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞株,A組:正常對(duì)照組,A549細(xì)胞株未經(jīng)過任何處理;B組:DDX43siRNA2+司美替尼組,載體DDX43siRNA2轉(zhuǎn)染24h肺腺癌A549細(xì)胞后,接著用10μmol/L司美替尼處理A549細(xì)胞12h;C組:司美替尼組,10μmol/L Selumetinib培養(yǎng)A549持續(xù) 12h。2.使用免疫印跡蛋白(Westernblot)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的DDX43蛋白表達(dá)情況;采用原位雜交、RT-PCR方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的DDX43mRNA 的表達(dá)。3.運(yùn)用流式細(xì)胞儀、MTT和TUNEL方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞凋亡和增殖情況。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:在具體的處理程序內(nèi)使用SPSS19.0軟件,使用χ2檢驗(yàn)、方差分析或者是t檢驗(yàn),實(shí)際的檢驗(yàn)水準(zhǔn)被確定為α = 0.05。結(jié)果1.免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot檢測(cè)結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,肺腺癌A549細(xì)胞中DDX43蛋白表達(dá)不斷的下降,兩方面的要素對(duì)比,其中的區(qū)別存在對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值(P0.05)。2.原位雜交及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,肺腺癌A549細(xì)胞中DDX43mRNA表達(dá)明顯上調(diào),組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.MTT法檢測(cè)結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)比較,A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.流式細(xì)胞技術(shù)及TUNEL檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡的結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)與B組(DDX43siRNA2+司美替尼組)相比,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著逐漸增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第四部分DDX43siRNA干擾表達(dá)載體體內(nèi)對(duì)司美替尼誘導(dǎo)的肺腺癌移植瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響方法1.構(gòu)建肺腺癌裸鼠移植瘤模型。2.分組飼養(yǎng)帶瘤裸鼠,A組:正常對(duì)照組,瘤體內(nèi)注射無菌生理鹽水;B組:DDX43 siRNA2+司美替尼組,瘤體內(nèi)注射DDX43 siRNA2及司美替尼(濃度:5mg/Kg);C組:司美替尼組,瘤體內(nèi)注射司美替尼(濃度5mg/Kg)。各實(shí)驗(yàn)組:3day/注射一次,共注射6次。3.觀察和記錄各實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)狀況,并繪制生長(zhǎng)曲線。4.采用免疫組化、Western blot方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中DDX43蛋白表達(dá)情況;5.運(yùn)用熒光原位雜交、RT-PCR方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中DDX43 mRNA的表達(dá)情況。6.采用TUNEL法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件處理,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、計(jì)量資料行t檢驗(yàn)或方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)的移植瘤體積顯著大于B組(DDX43siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.免疫組化和Western blot檢測(cè)蛋白的結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)的裸鼠移植瘤組織中DDX43蛋白表達(dá)明顯高于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.熒光原位雜交及RT-PCR檢測(cè)mRNA結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)的裸鼠移植瘤組織中DDX43 mRNA表達(dá)明顯高于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.TUNEL法檢測(cè)凋亡的結(jié)果:A組(正常對(duì)照組)和C組(司美替尼組)細(xì)胞中凋亡指數(shù)(AI)顯著低于B組(DDX43 siRNA2+司美替尼組),組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。全文結(jié)論1.DDX43在肺腺癌組織中高表達(dá)。2.肺腺癌發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移均與DDX43蛋白和mRNA表達(dá)有關(guān)。3.構(gòu)建好的載體中,成功篩選具有最好抑制效果的載體是DDX43siRNA2。4.人肺腺癌癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDX43 siRNA干擾表達(dá)載體后,細(xì)胞中DDX43蛋白和mRNA的表達(dá)均下調(diào)。5.沉默DDX43后聯(lián)合司美替尼可體外促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)司美替尼抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖。6.沉默DDX43后聯(lián)合司美替尼可體內(nèi)促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)司美替尼對(duì)肺腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

邐第一部分ＤＤＸ４３在肺腺癌組織中的表達(dá)及其意義邐逡逑表１．３正常肺組織組織、肺泡上皮高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及肺腺癌組織中ＤＤＸ４３蛋白表達(dá)逡逑Ｔａｂｌｅ邋１．３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＤＸ４３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ａｌｖｅｏｌａｒ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ，ａｌｖｅｏｌａｒ邋ａｔｙｐｉｃａｌ逡逑ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ邋ａｎｄ邋ＮＳＣＬＣ逡逑＾邐例數(shù)——Ｔ逡逑邐：邐＋邋陽(yáng)性率（％）邐逡逑正常肺組織邐６２邐６２邐０邐０逡逑肺腺癌邐６２邐７邐５５邐８８．７邐６３．１５邐０．００逡逑肺泡上皮不典型增生邐３１邐１９邐１２邐３８Ｊ邐逡逑？邐＞＇邋’邐１邋？？邐？《邐：＇．／邋１邐－？．心？？邋＾邐ｉ邐？＇邋＾逡逑

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本文編號(hào)：2823881