發(fā)布時間：2020-09-20 20:28

　　 惡性黑色素瘤(MM)是始發(fā)于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤,特點為快速發(fā)生,易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后差,是歐美淺膚色人種等國家皮膚癌死亡的首要原因。最常見的亞洲人群原發(fā)皮膚黑色素瘤主要為肢端黑色素瘤,約占全部黑色素瘤50%左右,上肢主要在手指末端及甲下,下肢主要在足趾和足底等部位。據(jù)統(tǒng)計,世界黑色素瘤每年的發(fā)病率以3%~8%的比例增多;黑色素瘤在我國發(fā)病率雖然在腫瘤中的比重較小,但總體為上升趨勢,新發(fā)病例每年約有2萬例,也是嚴(yán)重影響我國人民的生命健康病種之一,因此,對于晚期或擴散性黑色素瘤的針對性治療和早期診斷顯得尤為關(guān)鍵。目前治療黑色素瘤的最佳手段仍是以手術(shù)為主,但術(shù)后仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。在一些黑色素瘤晚期或不宜手術(shù)的患者,選擇其他適宜的治療方式十分必要;由于黑色素瘤對放射、化學(xué)療法不敏感,使這些療法的臨床有效治療率低,不能夠有效延長患者的生存率,而且這些治療方法對患者的免疫系統(tǒng)損傷較重。生物免疫治療如黑色素瘤疫苗等,多數(shù)還處于研發(fā)或臨床試驗階段,遠(yuǎn)期治療效果還需進(jìn)一步研究。近些年,靶向治療開辟了腫瘤治療的新方向,并有望成為黑色素瘤治療的主導(dǎo)方法。對于黑色素瘤診斷包括查體、活檢、影像學(xué)檢查及實驗室檢查等,但目前仍無特異的腫瘤標(biāo)志物,使其精確診斷受到了一定的限制。靶向藥物無論在臨床試驗還是未來臨床治療中都需要靶向診斷方法進(jìn)行病例篩選,只有確定適用病例后治療才有意義。靶向診斷方法的建立首先就要獲得靶向標(biāo)志物。本研究以促黑色素細(xì)胞激素(α-MSH)作為引導(dǎo)結(jié)構(gòu)與已經(jīng)優(yōu)化了密碼子的綠膿桿菌外毒素蛋白相結(jié)合,成功構(gòu)建一種高表達(dá)、特異性強的靶向MC1R(Melanocortin 1 Receptor)的重組毒素,并進(jìn)行了基因工程菌株發(fā)酵與純化研究;通過細(xì)胞毒性試驗及動物模型試驗來分析重組毒素的成藥性評價,分析不同細(xì)胞MC1R的表達(dá)量及其與重組毒素有效性之間的關(guān)系,為重組毒素在臨床上準(zhǔn)確治療及個體化治療提供指導(dǎo)。通過生物信息學(xué)預(yù)測并證明了TCEAL7與miRNA-758的表達(dá)關(guān)系密切,同時通過調(diào)節(jié)TCEAL7來研究miRNA-758與黑色素瘤潛在聯(lián)系,也證明了TCEAL7在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,miR-758/TCEAL7可能作為黑色素瘤新診斷的標(biāo)志物和治療靶點。為了進(jìn)一步獲得更高表達(dá)量的重組毒素以便于能夠工業(yè)化生產(chǎn),我們將實驗室保存的PE40毒素氨基酸序列,截短降低免疫原性,通過基因修飾將PE毒素羧基端的REDLK轉(zhuǎn)變?yōu)镵DEL多肽序列,增加活性。通過生物軟件的分析及PE優(yōu)化大腸桿菌嗜好密碼子,合成PE38KDEL,以柔性linker將其與a-MSH基因連接,獲得新構(gòu)建的a-MSH-PE38_(KDEL)基因克隆。將重組毒素基因轉(zhuǎn)入pET-30a載體,重組質(zhì)粒pET-30a/a-MSH-PE38_(KDEL)載體成功構(gòu)建,通過測序驗證序列。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosseta(DE3)感受態(tài)受體菌株中,經(jīng)卡那霉素抗性篩選后,以PCR及DNA測序驗證。對鑒定陽性克隆菌株保種后以LB培養(yǎng)基發(fā)酵、IPTG誘導(dǎo),經(jīng)電泳基因水平分析和蛋白水平鑒定表達(dá)產(chǎn)物,層析掃描確定a-MSH-PE38_(KDEL)重組蛋白的表達(dá)量占全菌總蛋白的35%以上。利用Western blot對超聲破碎后菌體進(jìn)行分析,證明融合蛋白以有活性的可溶性表達(dá)產(chǎn)物、不直接表現(xiàn)活性的包涵體表達(dá)產(chǎn)物兩種形式存在。對重組蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的可溶性表達(dá)采取粗略純化與精細(xì)純化相結(jié)合的工藝方式進(jìn)行純化。首先采用鹽析法的硫酸銨沉淀法初步去除大部分雜質(zhì),再以疏水層析及離子交換層析對重組蛋白沉淀物進(jìn)行精細(xì)純化,最后以凝膠過濾層析法脫鹽和純化,并對飽和硫酸銨沉淀和層析條件進(jìn)行優(yōu)化。對于重組蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)包涵體采取復(fù)性方式純化,對包涵體進(jìn)行反復(fù)的變性、復(fù)性,對復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行親和層析。從純化結(jié)果看,這兩種純化方式終純度都較高,均可滿足后續(xù)實驗要求。以細(xì)胞殺傷活性分析重組毒素a-MSH-PE38_(KDEL)對MC1R受體結(jié)合競爭情況;流式細(xì)胞儀分析重組毒素是否能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡;選取人A375細(xì)胞、鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10進(jìn)行體外生物活性實驗,因為這些細(xì)胞高表達(dá)MC1R;并以低表達(dá)MC1R的人正常肝細(xì)胞LO2、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD、人胃癌細(xì)胞BGC-823作對照,驗證重組毒素的靶向殺傷作用。實驗結(jié)果證明a-MSH-PE38_(KDEL)確實是通過與MC1R結(jié)合后發(fā)揮毒性作用的,而其發(fā)揮毒性作用的機制之一就是內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與目前上市的多數(shù)靶向藥物對腫瘤細(xì)胞信號干擾等相比,本實驗中的重組毒素針對的是腫瘤細(xì)胞表面受體標(biāo)志,不易受到其他因素干擾,其效果可能要優(yōu)于信號干擾藥物。a-MSH-PE38_(KDEL)對人正常肝臟細(xì)胞L02無殺傷作用,對黑色素瘤細(xì)胞A375及B16-F10細(xì)胞的殺傷率為93%。進(jìn)一步分析a-MSH-PE38_(KDEL)重組毒素的體內(nèi)抗腫瘤活性,采取皮下接種B16-F10細(xì)胞懸液建立BALB/c鼠黑色素瘤模型,并用a-MSH-PE38_(KDEL)對荷瘤小鼠進(jìn)行治療,分析重組毒素的抑瘤效果、毒副作用以及獲得安全性評價等。重組毒素治療分高、中、低三組,治療組BALB/c鼠的腫瘤生長緩慢、未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移;而其中以高劑量組治療效果更為明顯,腫瘤消失率為58.3%;長期給予高劑量重組毒素治療后(50天),治療組7只BALB/c鼠中有4只腫瘤完全消失。組織病理及電鏡結(jié)果顯示a-MSH-PE38_(KDEL)對BALB/c鼠無明顯的毒副作用。MC1R在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞和組織中的分布差異表明其有可能作為檢測或靶向治療的靶標(biāo),我們初步建立了一種MC1R的檢測方法。分別利用蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR法對不同細(xì)胞表面上的MC1R定量檢測,分析樣本中MC1R的含量與a-MSH-PE38_(KDEL)有效性之間的關(guān)系。檢測的12種細(xì)胞中,驗證了B16-F10細(xì)胞中MC1R mRNA的高表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29和人食管癌細(xì)胞eca-109中MC1R mRNA的表達(dá)量較黑色素瘤細(xì)胞B16-F10要高3-5倍,HCT-116(人結(jié)直腸癌細(xì)胞)與B16-F10細(xì)胞的mRNA表達(dá)量接近,并且熒光定量PCR與蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果基本一致。說明a-MSH-PE38_(KDEL)除了MM細(xì)胞外可能具有更強的新的潛在腫瘤靶點。在很多腫瘤中能夠見到人轉(zhuǎn)錄延長因子A(SII)-樣7(TCEAL7)的異位表達(dá),其中包括惡性黑色素瘤,但其功能并不明確。本實驗通過Western blot和qPCR方法證明了TCEAL7在黑色素瘤組織及細(xì)胞系A(chǔ)375和WM-115中表達(dá)量較低;通過慢病毒感染上調(diào)了TCEAL7在A375和WM-115細(xì)胞系中的表達(dá)量;轉(zhuǎn)染siRNA-TCEAL7下調(diào)TCEAL7的表達(dá),CCK-8檢測法來評估TCEAL7對黑色素瘤生長的影響;流式細(xì)胞儀來檢測TCEAL7在細(xì)胞凋亡過程中的作用。結(jié)果表明下調(diào)TCEAL7表達(dá)量可促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生及抑制黑色素瘤凋亡。4周齡雌性BALB/c裸鼠,分別在裸鼠背側(cè)皮下注射含有1×10~7轉(zhuǎn)染siRNA和慢病毒感染后的A375和WM-115細(xì)胞。結(jié)果顯示上調(diào)TCEAL7的表達(dá)量會抑制腫瘤的發(fā)生,下調(diào)時則會促進(jìn)其生長。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明miRNA-758的表達(dá)量與TCEAL7關(guān)系密切,通過qPCR證明轉(zhuǎn)染mimics-miR-758的黑色素瘤細(xì)胞A375和WM-115中miRNA-758過表達(dá),而Western blot卻顯示TCEAL7為低表達(dá);雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明,在黑色素瘤A375和WM-115細(xì)胞上調(diào)表達(dá)miR-758后,TCEAL7的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。進(jìn)一步分析了miR-758的異位表達(dá)在惡性黑色素瘤發(fā)展中的作用。WM-115和A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-758的CCK-8檢測結(jié)果顯示,該基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖能力;而基于mimics-miR-758過表達(dá)TCEAL7時,對細(xì)胞增殖的作用被削弱了。并且,當(dāng)WM-115和A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-758后,細(xì)胞凋亡被抑制;而基于mimics-miR-758過表達(dá)TCEAL7時,這種被過表達(dá)miR-758誘導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡作用亦被抑制。上述結(jié)果表明,TCEAL7為黑色素瘤的一種抑癌基因,可抑制黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展;miRNA-758為TCEAL7的上游調(diào)控因子,可通過下調(diào)TCEAL7表達(dá)水平,來發(fā)揮促癌作用�？傊�,本試驗通過PE40密碼子優(yōu)化,將基因工程菌株目的蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的表達(dá)量從出發(fā)株原來的10%提高到現(xiàn)在的35%~40%;確定了實驗室規(guī)模的a-MSH-PE38_(KDEL)可溶性和包涵體表達(dá)產(chǎn)物的純化工藝,獲得純度超過95%以上的重組毒素產(chǎn)品;通過細(xì)胞水平試驗明確靶向腫瘤細(xì)胞系,同時確定了使用劑量,為動物試驗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);通過黑色素瘤動物模型治療試驗明確了靶向黑色素瘤的強效殺傷作用,重組毒素能夠快速消除鼠體內(nèi)的黑色素瘤,臨床觀察、病理組織學(xué)切片和電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)觀察未見明顯異常,證明其安全性好,是一種非常有前景的黑色素瘤的候選靶向藥物;明顯優(yōu)于達(dá)卡巴嗪和順鉑化療藥治療效果,觀察到化療藥物治療組中存在超微結(jié)構(gòu)病理變化;細(xì)胞靶向篩選中發(fā)現(xiàn)了重組毒素的新腫瘤靶標(biāo):人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和人食管癌細(xì)胞eca-109,而且靶向殺傷作用比黑色素瘤細(xì)胞B16-F10還要強幾倍;通過黑色素瘤臨床樣本分析,認(rèn)為miR-758/TCEAL7可能作為一個新的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。希望本實驗的結(jié)果能為未來的臨床試驗及黑色素瘤個性化治療提供一定的參考。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第 2 章 惡性黑色素瘤靶向藥物治療13圖2.1 黑色素瘤細(xì)胞常見發(fā)生在皮膚上的位置Fig.2.1 The location of a melanoma cell commonly occurring on the skin2.1 針對惡性黑色素瘤主要特異信號通路的靶向治療MM發(fā)病機制在一定程度上取決于黑色素細(xì)胞DNA突變導(dǎo)致相關(guān)癌基因被激活或抑癌基因失活，反過來導(dǎo)致染色體異常，最終誘發(fā)惡性黑色素瘤發(fā)生。過度陽光照射可能是誘因之一，特別是白色人種。有黑色素瘤家族史的患者約40%帶有CDKN2A基因，該類基因受損時導(dǎo)致抑癌基因（如RB，p53）功能受損[74-76]。MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）通路失調(diào)是大部分黑色素瘤特征之一，該信號通路是由RAS→RAF→MEK→ERK等蛋白激酶組成，這種信號通路通過瀑布效應(yīng)依次催化下級蛋白激酶而完成活化，可被細(xì)胞外多種信號因子激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞惡性變化

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文14圖2.2 黑色素瘤易基因突變的信號通路及基因Fig.2.2 The signal pathway and gene mutations of melanoma現(xiàn)在開發(fā)的多種靶向黑色素瘤藥物就是針對其中的某個信號蛋白來干擾其進(jìn)一步傳遞過程，從而達(dá)到治療目的。2.1.1 BRAF 抑制劑（1）維羅菲尼就在幾年前晚期黑色素瘤或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤主要依靠化學(xué)藥物治療，應(yīng)答率不超過10%，患者預(yù)后很差。美國FDA在2011年批準(zhǔn)BRAFV600E突變抑制劑維羅菲尼（vemurafenib/Zelboraf/PLX4032)上市，靶向新藥研發(fā)獲得了重要突破。以往經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)約有50%的進(jìn)展型MM有BRAFV600E變異發(fā)生，在突變的病例中維羅菲尼的反應(yīng)率達(dá)到了50%，比化學(xué)藥物治療延長至少3個月以上的生存期。維羅菲尼當(dāng)時被認(rèn)為是黑色素瘤治療所取得的最突出的進(jìn)展，也是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤個性化治療的比較理想的典范。但后來又出現(xiàn)了PD-1抑制劑甚至超過了一半應(yīng)答率。維羅菲尼在半年左右開始出現(xiàn)耐藥

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第 2 章 惡性黑色素瘤靶向藥物治療15圖2.3 黑色素瘤相關(guān)的信號通路Fig.2.3 Major pathways involved in melanoma[78]. Pathways associated with cellproliferation, survival, and variation are figurely presented. Arrows show activatingsignals; interrupted lines, inhibiting signals. AMPK, AMP-activated protein kinase;Aurk, Aurora kinase; BAD, BCL-2 antagonist of cell death; CDK4, cyclin-dependentkinase 4; CDKN2A, cyclin-dependent kinase inhibitor of kinase 2A; ERK,extracellular-related kinase; HGF, hepatocyte growth factor; MITF,microphthalmia-associated transcription factor; MEK, mitogen-activated proteinkinase-extracellular-related kinase; PI3K, phosphatidylinositol 3 kinase; PTEN,phosphatase and tensin homolog; RB, retinoblastoma protein; TERT, telomerasereverse transcriptase.在惡性黑色素瘤或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，針對BRAFV600E常見突變和RAFV600K偶發(fā)突變，維羅菲尼都能明顯改善患者狀況并延長生存期。澳大利亞Peter MacCallum 腫瘤中心的 Grant A McArthur等對此種亞組病例擴大隨訪[79,80]。隨訪18歲以上患者、有BRAFV600變異但未經(jīng)治療的MM患者，曾經(jīng)維羅菲尼抗瘤試驗。隨機將受試者分為2 組，一組為每日兩次口服維羅菲尼960 mg治療組，另一組按照1000 mg/m2體表面積每3周靜脈注射一次達(dá)卡巴嗪。在12個國家總計包括104個研究分中心進(jìn)行試驗，包括675名受試者，實?

【參考文獻(xiàn)】

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2 李欣;石三軍;周敏;盧來春;;酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼抗黑色素瘤的體外研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2016年23期

3 李燕雛;鄭雪梅;李平;;沙利度胺聯(lián)合三苯氧胺治療Ⅳb期牙齦惡性黑色素瘤一例[J];華西醫(yī)學(xué);2015年10期

4 劉斌;鄧辰亮;楊松林;萬偉東;楊波;茅廣宇;仲乾乾;鄭江紅;;姜黃素對人黑色素瘤細(xì)胞凋亡機制探討[J];中華腫瘤防治雜志;2014年14期

5 楊愛榮;;紅景天苷對人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖和凋亡的影響[J];山東醫(yī)藥;2014年13期

本文編號：2823110