發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 22:36

　　 【背景】胃癌是全球四大惡性腫瘤之一,是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的重要原因。由于缺乏有效地早期篩查手段,大部分胃癌患者就診時(shí),疾病已進(jìn)入中晚期。對(duì)于晚期胃癌患者,化學(xué)治療往往作為首要治療方案。盡管目前已有多種化療藥物應(yīng)用于臨床,但是先天或獲得性耐藥尤其是多藥耐藥的出現(xiàn)最終導(dǎo)致化療失敗,甚至出現(xiàn)無藥可醫(yī)的局面。經(jīng)過多年探索,研究者已發(fā)現(xiàn)多種多藥耐藥相關(guān)分子機(jī)制,然而有關(guān)胃癌多藥耐藥的確切機(jī)制至今尚未完全闡明。近期研究發(fā)現(xiàn),micro RNA(mi RNA)可通過負(fù)性調(diào)控耐藥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞耐藥。但截止目前,僅有少數(shù)幾個(gè)mi RNAs被報(bào)道通過直接調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)通路而參與胃癌細(xì)胞耐藥。因此,有關(guān)mi RNA調(diào)控胃癌耐藥的確切分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本課題組前期研究中通過mi RNA表達(dá)譜芯片及高通量功能篩選發(fā)現(xiàn)一系列胃癌耐藥相關(guān)的mi RNAs。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn)mi R-23b-3p可能在逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞耐藥的過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。因此,本研究擬在前期工作基礎(chǔ)之上,深入探討mi R-23b-3p在胃癌細(xì)胞耐藥過程中的功能并闡明其可能的分子機(jī)制。最后通過組織芯片和原位雜交技術(shù)明確mi R-23b-3p表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。【目的】1.探討mi R-23b-3p在胃癌多藥耐藥中的功能并闡明其相關(guān)分子機(jī)制。2.明確mi R-23b-3p與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。【方法】1.首先通過q RT-PCR檢測(cè)mi R-23b-3p在胃癌耐藥細(xì)胞模型中的表達(dá)情況。進(jìn)一步通過功能獲得、功能缺失及MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi R-23b-3p的表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性和增殖的影響。2.采用生物信息學(xué)綜合分析和篩選mi R-23b-3p下游潛在的靶基因。通過q RT-PCR,Western blot,Confocal laser scanning microscopy(CLSM,激光共聚焦顯微鏡)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及雙熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證候選靶基因的表達(dá)及mi R-23b-3p對(duì)靶基因的調(diào)控作用。通過RNAi,q RT-PCR,Western blot及MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因在胃癌細(xì)胞的功能,同時(shí)明確兩個(gè)靶基因之間是否存在調(diào)控關(guān)系。3.通過透射電鏡(TEM)、Western blot,CLSM等觀察胃癌多藥耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞之間的自噬水平變化。4.通過RNAi,Western blot,自噬抑制劑CQ等檢測(cè)靶基因?qū)ξ赴┘?xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用以及自噬對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響。5.通過轉(zhuǎn)染mi RNA inhibitor或mimics、CLSM,Western blot等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi R-23b-3p對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用。此外,通過q RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化療藥物5-Fu處理另外兩種胃腺癌細(xì)胞AGS和BGC823前后,細(xì)胞內(nèi)mi R-23b-3p、靶基因及自噬表達(dá)水平的變化。進(jìn)一步運(yùn)用共轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)方法,明確mi R-23b-3p是否通過直接抑制靶基因介導(dǎo)的自噬進(jìn)而參與調(diào)控胃癌細(xì)胞耐藥。6.通過構(gòu)建mi R-23b-3p慢病毒表達(dá)載體、建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-23b-3p或?qū)φ蛰d體的胃癌耐藥細(xì)胞系以及裸鼠皮下成瘤等實(shí)驗(yàn),檢測(cè)mi R-23b-3p能否在體內(nèi)水平逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的作用。7.通過q RT-PCR、免疫組織化學(xué)、胃癌組織芯片以及原位雜交等技術(shù)檢測(cè)mi R-23b-3p及其靶基因在胃癌組織標(biāo)本的表達(dá)情況,進(jìn)而分析mi R-23b-3p與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。8.通過生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)mi R-23b-3p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游Cp G島分布情況,同時(shí)應(yīng)用q RT-PCR檢測(cè)去甲基化處理胃癌細(xì)胞前后,mi R-23b-3p的表達(dá)變化。【結(jié)果】1.過表達(dá)mi R-23b-3p顯著增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性與親本細(xì)胞SGC7901相比,mi R-23b-3p在胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR中的表達(dá)水平顯著降低。上調(diào)mi R-23b-3p表達(dá)后,耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR對(duì)5-FU,VCR及CDDP的藥物敏感性顯著增強(qiáng);相反,當(dāng)下調(diào)SGC7901細(xì)胞中mi R-23b-3p的表達(dá)水平后其對(duì)上述三種藥物的敏感性顯著降低。此外,改變mi R-23b-3p的表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖無顯著影響。2.ATG12和HMGB2是mi R-23b-3p的直接靶基因經(jīng)過生物信息學(xué)分析,初步將ATG12和HMGB2作為mi R-23b-3p的候選靶基因。進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí),ATG12和HMGB2在胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中表達(dá)顯著升高。mi R-23b-3p通過結(jié)合ATG12和HMGB2的3’非翻譯區(qū)降解其m RNA水平而直接負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。下調(diào)ATG12和HMGB2表達(dá)后,胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)5-FU、VCR及CDDP的敏感性顯著增加。此外,當(dāng)下調(diào)HMGB2表達(dá)時(shí),ATG12表達(dá)水平同時(shí)下調(diào);而下調(diào)ATG12表達(dá)時(shí),HMGB2表達(dá)水平無明顯變化。3.胃癌多藥耐藥細(xì)胞的自噬水平顯著增強(qiáng)TEM和CLSM均檢測(cè)發(fā)現(xiàn):胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中自噬體數(shù)目顯著多于親本細(xì)胞SGC7901。Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn):自噬分子標(biāo)志LC3II在SGC7901/VCR表達(dá)升高而p62表達(dá)降低;而在親本細(xì)胞SGC7901中兩者的表達(dá)則相反。4.抑制自噬可顯著提高胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性通過si RNA技術(shù)下調(diào)ATG12或HMGB2表達(dá)后,胃癌耐藥細(xì)胞的自噬水平較前顯著下降。另外,在胃癌細(xì)胞中加入自噬抑制劑CQ后,與親本細(xì)胞相比,LC3II在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著增高,與此同時(shí)胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)5-FU、VCR及CDDP的敏感性顯著增加。5.mi R-23b-3p通過抑制ATG12和HMGB2介導(dǎo)的自噬進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞耐藥轉(zhuǎn)染mi RNA mimics上調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中mi R-23b-3p的表達(dá)后,SGC7901/VCR自噬水平較前明顯下降;而轉(zhuǎn)染mi RNA inhibitor下調(diào)mi R-23b-3p表達(dá)后,親本細(xì)胞SGC7901的自噬水平較前增強(qiáng)。此外,當(dāng)應(yīng)用低濃度5-Fu與細(xì)胞共培養(yǎng)后,胃腺癌細(xì)胞系BGC823和AGS中mi R-23b-3p的表達(dá)下降而ATG12、HMGB2以及LC3I/II的表達(dá)水平均較前明顯升高。進(jìn)一步在下調(diào)mi R-23b-3p表達(dá)基礎(chǔ)上,下調(diào)SGC7901中ATG12和HMGB2表達(dá)水平可明顯減弱mi R-23b-3p下調(diào)所介導(dǎo)的細(xì)胞耐藥的作用。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)mi R-23b-3p的表達(dá)可顯著提高胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性q RT-PCR結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的細(xì)胞相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-23b-3p的細(xì)胞中mi R-23b-3p的表達(dá)水平升高500多倍。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功后行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí):在未給予腹腔注射化療藥物之前,轉(zhuǎn)染Lenti-mi R-23b-3p和Lenti-mi R-NC的細(xì)胞體內(nèi)增殖趨勢(shì)無顯著差異。而給予裸鼠周期性腹腔注射藥物后,轉(zhuǎn)染Lenti-mi R-23b-3p的腫瘤體積較對(duì)照組顯著減小。提示穩(wěn)定表達(dá)mi R-23b-3p的SGC7901/VCR細(xì)胞在體內(nèi)的藥物敏感性依然顯著高于轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的細(xì)胞。7.mi R-23b-3p在胃癌化療耐藥患者組織中表達(dá)降低,其表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物化療耐藥的胃癌組織中ATG12和HMGB2的表達(dá)水平較化療敏感組織顯著增高而mi R-23b-3p的表達(dá)水平卻顯著降低。另外,原位雜交和組織芯片結(jié)果顯示:mi R-23b-3p在臨床胃癌患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期等分組中表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但其表達(dá)水平在遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移分組中存在顯著差異(p=0.005)。同時(shí),生存分析發(fā)現(xiàn),mi R-23b-3p表達(dá)水平較高的胃癌患者的總生存時(shí)間顯著優(yōu)于mi R-23b-3p低表達(dá)患者(Log-rank檢驗(yàn),P=0.0143)。8.初步證實(shí)mi R-23b-3p表達(dá)DNA受甲基化調(diào)控通過甲基化軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-23b-3p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游存在多個(gè)Cp G島。應(yīng)用5-氮雜胞苷(5-Aza)去甲基化處理后,胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中mi R-23b-3p表達(dá)水平較前顯著升高而SGC7901中mi R-23b-3p表達(dá)水平無明顯變化�！窘Y(jié)論】甲基化介導(dǎo)的mi R-23b-3p通過靶向ATG12和HMGB2來抑制自噬進(jìn)而參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞多藥耐藥。mi R-23b-3p表達(dá)水平較高的胃癌患者其總生存時(shí)間顯著優(yōu)于mi R-23b-3p表達(dá)水平較低或陰性的患者。因此,mi R-23b-3p是一個(gè)新的與胃癌多藥耐藥相關(guān)的mi RNA,有望成為潛在的預(yù)測(cè)胃癌多藥耐藥的分子標(biāo)志物和逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

球腫瘤最新統(tǒng)計(jì)，僅 2012 年，世界范圍內(nèi)胃癌的新發(fā)病例約致死的病例卻高達(dá) 723,100 例。此外，全球統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)胃癌的分點(diǎn)。總體來說，東亞地區(qū)的胃癌發(fā)病率最高，尤其是朝鮮、北美洲和非洲大部地區(qū)胃癌的發(fā)病率最低[1]（圖 1）。

.1 DNA 損傷修復(fù)與腫瘤耐藥許多化療藥物以 DNA 作為最終靶點(diǎn)，通過直接或間接損傷腫瘤細(xì)胞 DNA抗腫瘤作用。而 DNA 損傷修復(fù)則是在基因組內(nèi)出現(xiàn)各種損傷時(shí)機(jī)體細(xì)胞的自性反應(yīng)。通常情況下，腫瘤細(xì)胞通過自身修復(fù)或去除受損 DNA 來維持基因組息的相對(duì)穩(wěn)定和完整。因此，DNA 損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)與 MDR 密切相關(guān)[

P-gp 與人體多種腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)，因此，通過靶向 P-gp 逆轉(zhuǎn)研究的熱點(diǎn)。如 Gao L 等發(fā)現(xiàn)將抑制 P-gp 的表面活性材料包被紫杉醇肺癌細(xì)胞耐藥[39]。c-Jun N 端激酶抑制劑 SP600125 通過抑制 P-gp 而顯藥細(xì)胞 KBV20C 對(duì)化療藥物的敏感性[40]。在胃癌耐藥研究中，舒尼替-gp和BCL-2等靶點(diǎn)可顯著增強(qiáng)胃癌多藥耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR對(duì)順霉素，長(zhǎng)春新堿等多種化療藥物的敏感性[41]。盡管 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族藥中的發(fā)揮重要作用，同時(shí)以其家族成員作為靶點(diǎn)也研發(fā)了多種特異由于毒副作用等多種原因，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族抑制劑在臨床實(shí)踐中并治療效果[42]，有待于進(jìn)一步改進(jìn)。干細(xì)胞與腫瘤耐藥干細(xì)胞（Cancer stem cell，CSC）是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。CSC、無限增殖及分化的潛能，廣泛參與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等多種生前越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，CSC 是腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥的重要原因之一。

本文編號(hào)：2823082